轉載 給學徒的ATAC-seq數據實戰

本次給學徒講解的文章是 :The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature 2016 Jun 30;534(7609):652-7. PMID: 27309802

查看文章發現數據上傳到了GEO，是：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE66581

在SRA數據庫可以下載原始測序數據 , 從文章找到數據的ID： https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra?term=SRP055881 把下面的內容保存到文件，命名為 srr.list 就可以使用prefetch這個函數來下載。

linux環境及軟件安裝

這里首推conda

# https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/help/anaconda/
# https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/miniconda/ 
wget https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/miniconda/Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh
bash Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh
source ~/.bashrc 
## 安裝好conda后需要設置鏡像。
conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/pkgs/free
conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/cloud/conda-forge
conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/cloud/bioconda
conda config --set show_channel_urls yes

conda  create -n atac -y   python=2 bwa
conda info --envs
source activate atac
# 可以用search先進行檢索
conda search trim_galore
## 保證所有的軟件都是安裝在 wes 這個環境下面
conda install -y sra-tools  sambamba 
conda install -y trim-galore  samtools bedtools
conda install -y deeptools homer  meme
conda install -y macs2 bowtie bowtie2 
conda install -y  multiqc

代碼里面提到的軟件，都是根據我們對ATAC-seq搜索學習總結的。
值得一提的是自己為了ATAC-seq建立的軟件環境可以很方便移植到另外一臺電腦!
首先通過activate target_env要分享的環境target_env，然后輸入下面的命令會在當前工作目錄下生成一個environment.yml文件，
conda env export > environment.yml
小伙伴拿到environment.yml文件后，將該文件放在工作目錄下，可以通過以下命令從該文件創建環境
conda env create -f environment.yml

下載作者的數據

前面提到的SRA數據庫，該文章配套數據太多，我們節選部分作為練習，文件config.sra 如下：

2-cell-1 SRR2927015
2-cell-2 SRR2927016
2-cell-5 SRR3545580
2-cell-4 SRR2927018

因為conda安裝好了sra-toolkit，所以prefetch函數可以直接使用

## 下載數據 
# cat srr.list |while read id;do (nohup $prefetch $id -X 100G  & );done
## 注意組織好自己的項目
mkdir -p  ~/project/atac/
cd ~/project/atac/
mkdir {sra,raw,clean,align,peaks,motif,qc}
cd sra 
## vim 或者cat命令創建 srr.list 文件, 里面保存著作為練習使用的4個數據ID 
source activate atac 
cat srr.list |while read id;do ( nohup  prefetch $id & );done
## 默認下載目錄：~/ncbi/public/sra/ 
ls -lh ~/ncbi/public/sra/
## 下載耗時，自行解決，學員使用現成數據：/public/project/epi/atac/sra 

## 假如提前下載好了數據。
cd ~/project/atac/ 
ln -s /public/project/epi/atac/sra  sra

總之數據如下：

-rw-r--r-- 1 stu stu 4.2G Aug 25 11:10 SRR2927015.sra
-rw-r--r-- 1 stu stu 5.5G Aug 25 11:13 SRR2927016.sra
-rw-r--r-- 1 stu stu 2.0G Aug 25 11:12 SRR2927018.sra
-rw-r--r-- 1 stu stu 7.0G Aug 25 11:13 SRR3545580.sra

第一步，得到fastq測序數據

通常我們應該是自己的實驗數據，自己找公司測序后拿到原始數據，本次講解使用的是公共數據，所以需要把下載的sra數據轉換為fq格式。

## 下面需要用循環
cd ~/project/atac/
source activate atac
dump=fastq-dump
analysis_dir=raw
mkdir -p $analysis_dir
## 下面用到的 config.sra 文件，就是上面自行制作的。

# $fastq-dump sra/SRR2927015.sra  --gzip --split-3  -A 2-cell-1 -O clean/
cat config.sra |while read id;
do echo $id
arr=($id)
srr=${arr[1]}
sample=${arr[0]}
#  測序數據的sra轉fasq
nohup $dump -A  $sample -O $analysis_dir  --gzip --split-3  sra/$srr.sra & 
done 

### 如果不只是4個文件，需要使用shell腳本批處理。
cut -f  10,13 SRP055881/SraRunTable.txt|\
sed 's/Embryonic stem cell/ESC/'|sed 's/early 2-cell/e2-cell/' |\
perl -alne '{$h{$F[1]}++;print "$_-$h{$F[1]}"}' |tail -n+2|awk '{print $2"\t"$1}'> config.sra

得到的原始fq數據如下:

-rw-rw-r-- 1 jmzeng jmzeng 2.6G Aug 24 23:10 2-cell-1_1.fastq.gz
-rw-rw-r-- 1 jmzeng jmzeng 2.6G Aug 24 23:10 2-cell-1_2.fastq.gz
-rw-rw-r-- 1 jmzeng jmzeng 3.4G Aug 24 23:31 2-cell-2_1.fastq.gz
-rw-rw-r-- 1 jmzeng jmzeng 3.7G Aug 24 23:31 2-cell-2_2.fastq.gz
-rw-rw-r-- 1 jmzeng jmzeng 1.2G Aug 24 22:46 2-cell-4_1.fastq.gz
-rw-rw-r-- 1 jmzeng jmzeng 1.2G Aug 24 22:46 2-cell-4_2.fastq.gz
-rw-rw-r-- 1 jmzeng jmzeng 4.4G Aug 24 23:52 2-cell-5_1.fastq.gz
-rw-rw-r-- 1 jmzeng jmzeng 4.9G Aug 24 23:52 2-cell-5_2.fastq.gz

第二步，測序數據的質量控制

這個時候選擇trim_galore軟件進行過濾，雙端測序數據的代碼如下:
需要自行制作 config.raw 文件， 是3列，第一列占位用，沒有意義，第二列是fq1的地址，第3列是fq2的地址。

cd ~/project/atac/
mkdir -p clean 
source activate atac  
# trim_galore -q 25 --phred33 --length 35 -e 0.1 --stringency 4 --paired -o clean/ raw/2-cell-1_1.fastq.gz raw/2-cell-1_2.fastq.gz
cat config.raw  |while read id;
do echo $id
arr=($id)
fq2=${arr[2]}
fq1=${arr[1]}
sample=${arr[0]}
nohup  trim_galore -q 25 --phred33 --length 35 -e 0.1 --stringency 4 --paired -o  clean  $fq1   $fq2  & 
done 
ps -ef |grep trim

得到過濾后的fq文件如下：

-rw-rw-r-- 1 jmzeng jmzeng 2.4G Aug 25 09:35 2-cell-1_1_val_1.fq.gz
-rw-rw-r-- 1 jmzeng jmzeng 2.3G Aug 25 09:35 2-cell-1_2_val_2.fq.gz
-rw-rw-r-- 1 jmzeng jmzeng 3.1G Aug 25 10:10 2-cell-2_1_val_1.fq.gz
-rw-rw-r-- 1 jmzeng jmzeng 3.3G Aug 25 10:10 2-cell-2_2_val_2.fq.gz
-rw-rw-r-- 1 jmzeng jmzeng 1.1G Aug 25 08:52 2-cell-4_1_val_1.fq.gz
-rw-rw-r-- 1 jmzeng jmzeng 1.1G Aug 25 08:52 2-cell-4_2_val_2.fq.gz
-rw-rw-r-- 1 jmzeng jmzeng 3.7G Aug 25 10:27 2-cell-5_1_val_1.fq.gz
-rw-rw-r-- 1 jmzeng jmzeng 3.9G Aug 25 10:27 2-cell-5_2_val_2.fq.gz

質量控制前后都需要可視化，肯定是fastqc+multiqc，代碼如下；

cd ~/project/atac/qc 
mkdir -p clean 
fastqc -t 5  ../clean/2-cell-*gz -o clean 
mkdir -p raw 
fastqc -t 5  ../raw/2-cell-*gz -o clean 
# https://zh.wikipedia.org/wiki/ASCII
## 還有很多其它工具，比如：
qualimap='/home/jianmingzeng/biosoft/Qualimap/qualimap_v2.2.1/qualimap'
$qualimap bamqc --java-mem-size=20G  -bam $id  -outdir ./

第三步，比對

比對需要的index，看清楚物種，根據對應的軟件來構建，這里直接用bowtie2進行比對和統計比對率, 需要提前下載參考基因組然后使用命令構建索引，或者直接就下載索引文件：下載小鼠參考基因組的索引和注釋文件, 這里用常用的mm10

# 索引大小為3.2GB， 不建議自己下載基因組構建，可以直接下載索引文件，代碼如下：
mkdir referece && cd reference
wget -4 -q ftp://ftp.ccb.jhu.edu/pub/data/bowtie2_indexes/mm10.zip
unzip mm10.zip

解壓后的索引如下：

848M Jul  5 05:03 /public/reference/index/bowtie/mm10.1.bt2
633M Jul  5 05:00 /public/reference/index/bowtie/mm10.2.bt2
6.0K Jul  5 05:05 /public/reference/index/bowtie/mm10.3.bt2
633M Jul  5 05:05 /public/reference/index/bowtie/mm10.4.bt2 
848M Jul  5 04:52 /public/reference/index/bowtie/mm10.rev.1.bt2
633M Jul  5 04:49 /public/reference/index/bowtie/mm10.rev.2.bt2

這些索引文件一個都不能少，而且文件名的前綴很重要，保證一致。

單端測序數據的比對代碼如下：

首先可以對測試樣本走流程，完善代碼:

zcat ../clean/2-cell-1_1_val_1.fq.gz |head -10000 > test1.fq 
zcat ../clean/2-cell-1_2_val_2.fq.gz  |head -10000 > test2.fq
bowtie2 -x /public/reference/index/bowtie/mm10 -1 test1.fq  -2 test2.fq
bowtie2 -x /public/reference/index/bowtie/mm10 -1 test1.fq  -2 test2.fq  -S test.sam
bowtie2 -x /public/reference/index/bowtie/mm10 -1 test1.fq  -2 test2.fq  |samtools sort -@ 5 -O bam -o test.bam -
## 建議拋棄 samtools markdup功能，避免麻煩。
## http://www.lxweimin.com/p/1e6189f641db
samtools markdup -r  test.bam test.samtools.rmdup.bam 
## 把報錯信息在谷歌搜索后，在兩個網頁上找到了答案。
https://github.com/samtools/samtools/issues/765
https://www.biostars.org/p/288496/

## gatk 可以在GitHub下載
/public/biosoft/GATK/gatk-4.0.3.0/gatk  MarkDuplicates \
-I test.bam -O test.picard.rmdup.bam  --REMOVE_SEQUENCING_DUPLICATES true -M test.log 

### picards 被包裝在GATK里面：
### sambamba 文檔： http://lomereiter.github.io/sambamba/docs/sambamba-markdup.html
conda install -y  sambamba
sambamba --help
sambamba markdup --help
sambamba markdup -r test.bam  test.sambamba.rmdup.bam
samtools flagstat test.sambamba.rmdup.bam
samtools flagstat test.bam
## 接下來只保留兩條reads要比對到同一條染色體(Proper paired) ，還有高質量的比對結果(Mapping quality>=30)
## 順便過濾 線粒體reads
samtools view -f 2 -q 30  test.sambamba.rmdup.bam |grep -v chrM|wc
samtools view -f 2 -q 30  test.sambamba.rmdup.bam |wc
samtools view -h -f 2 -q 30  test.sambamba.rmdup.bam |grep -v chrM| samtools sort  -O bam  -@ 5 -o - > test.last.bam
bedtools bamtobed -i test.last.bam  > test.bed 
ls *.bam  |xargs -i samtools index {}

探索好了整個流程，就可以直接寫批處理，代碼如下：

ls /home/jmzeng/project/atac/clean/*_1.fq.gz > 1
ls /home/jmzeng/project/atac/clean/*_2.fq.gz > 2
ls /home/jmzeng/project/atac/clean/*_2.fq.gz |cut -d"/" -f 7|cut -d"_" -f 1  > 0
paste 0 1 2  > config.clean ## 供mapping使用的配置文件

cd ~/project/epi/align
## 相對目錄需要理解
bowtie2_index=/public/reference/index/bowtie/mm10
## 一定要搞清楚自己的bowtie2軟件安裝在哪里，以及自己的索引文件在什么地方！！！
#source activate atac 
cat config.clean |while read id;
do echo $id
arr=($id)
fq2=${arr[2]}
fq1=${arr[1]}
sample=${arr[0]}
## 比對過程15分鐘一個樣本
bowtie2  -p 5  --very-sensitive -X 2000 -x  $bowtie2_index -1 $fq1 -2 $fq2 |samtools sort  -O bam  -@ 5 -o - > ${sample}.raw.bam 
samtools index ${sample}.raw.bam 
bedtools bamtobed -i ${sample}.raw.bam  > ${sample}.raw.bed
samtools flagstat ${sample}.raw.bam  > ${sample}.raw.stat
# https://github.com/biod/sambamba/issues/177
sambamba markdup --overflow-list-size 600000  --tmpdir='./'  -r ${sample}.raw.bam  ${sample}.rmdup.bam
samtools index   ${sample}.rmdup.bam 

## ref:https://www.biostars.org/p/170294/ 
## Calculate %mtDNA:
mtReads=$(samtools idxstats  ${sample}.rmdup.bam | grep 'chrM' | cut -f 3)
totalReads=$(samtools idxstats  ${sample}.rmdup.bam | awk '{SUM += $3} END {print SUM}')
echo '==> mtDNA Content:' $(bc <<< "scale=2;100*$mtReads/$totalReads")'%'

samtools flagstat  ${sample}.rmdup.bam > ${sample}.rmdup.stat
samtools view  -h  -f 2 -q 30    ${sample}.rmdup.bam   |grep -v chrM |samtools sort  -O bam  -@ 5 -o - > ${sample}.last.bam
samtools index   ${sample}.last.bam 
samtools flagstat  ${sample}.last.bam > ${sample}.last.stat 
bedtools bamtobed -i ${sample}.last.bam  > ${sample}.bed
done

其中bowtie2比對加入了-X 2000 參數，是最大插入片段，寬泛的插入片段范圍(10-1000bp)

第一步得到的bam文件如下：

-rw-rw-r-- 1 stu stu 3.7G Aug 25 14:17 2-cell-1.bam
-rw-rw-r-- 1 stu stu 4.6G Aug 25 15:32 2-cell-2.bam
-rw-rw-r-- 1 stu stu 1.8G Aug 25 15:47 2-cell-4.bam
-rw-rw-r-- 1 stu stu 5.5G Aug 25 16:49 2-cell-5.bam

過濾后的bam文件是：

3.7G Aug 25 21:08 2-cell-1.bam
490M Aug 25 21:14 2-cell-1.last.bam
776M Aug 25 21:13 2-cell-1.rmdup.bam
4.6G Aug 25 23:51 2-cell-2.bam
678M Aug 25 23:58 2-cell-2.last.bam
1.1G Aug 25 23:57 2-cell-2.rmdup.bam
1.8G Aug 26 00:41 2-cell-4.bam
427M Aug 26 00:43 2-cell-4.last.bam
586M Aug 26 00:43 2-cell-4.rmdup.bam
5.5G Aug 26 03:26 2-cell-5.bam
523M Aug 26 03:33 2-cell-5.last.bam
899M Aug 26 03:32 2-cell-5.rmdup.bam

上述腳本的步驟都可以拆分運行，比如bam文件構建index或者轉為bed的:

ls *.last.bam|xargs -i samtools index {} 
ls *.last.bam|while read id;do (bedtools bamtobed -i $id >${id%%.*}.bed) ;done
ls *.raw.bam|while read id;do (nohup bedtools bamtobed -i $id >${id%%.*}.raw.bed & ) ;done

最后得到的bed文件是：

237M Aug 26 08:00 2-cell-1.bed
338M Aug 26 08:01 2-cell-2.bed
203M Aug 26 08:01 2-cell-4.bed
254M Aug 26 08:01 2-cell-5.bed

第4步，使用macs2找peaks

# macs2 callpeak -t 2-cell-1.bed  -g mm --nomodel --shift -100 --extsize 200  -n 2-cell-1 --outdir ../peaks/
ls *.bed | while read id ;do (macs2 callpeak -t $id  -g mm --nomodel --sHit  -100 --extsize 200  -n ${id%%.*} --outdir ../peaks/) ;done 
## shell 13問

macs2軟件說明書詳見：http://www.lxweimin.com/p/21e8c51fca23

第5步，計算插入片段長度，FRiP值，IDR計算重復情況

非冗余非線粒體能夠比對的fragment、比對率、NRF、PBC1、PBC2、peak數、無核小體區NFR、TSS富集、FRiP 、IDR重復的一致性！

名詞解釋：https://www.encodeproject.org/data-standards/terms/

參考：https://www.encodeproject.org/atac-seq/

看 sam文件第9列，在R里面統計繪圖

cmd=commandArgs(trailingOnly=TRUE); 
input=cmd[1]; output=cmd[2]; 
a=abs(as.numeric(read.table(input)[,1])); 
png(file=output);
hist(a,
main="Insertion Size distribution",
ylab="Read Count",xlab="Insert Size",
xaxt="n",
breaks=seq(0,max(a),by=10)
); 

axis(side=1,
at=seq(0,max(a),by=100),
labels=seq(0,max(a),by=100)
);

dev.off()

有了上面的繪圖R腳本就可以在批量檢驗bam文件進行出圖。

還有NFR:https://github.com/GreenleafLab/NucleoATAC/issues/18

FRiP值的計算：fraction of reads in called peak regions

bedtools intersect -a ../new/2-cell-1.bed -b 2-cell-1_peaks.narrowPeak |wc -l
148928
wc ../new/2-cell-1.bed
5105844
wc ../new/2-cell-1.raw.bed
5105844
### 搞清楚 FRiP值具體定義：


ls *narrowPeak|while  read id;
do 
echo $id
bed=../new/$(basename $id "_peaks.narrowPeak").raw.bed
#ls  -lh $bed 
Reads=$(bedtools intersect -a $bed -b $id |wc -l|awk '{print $1}')
totalReads=$(wc -l $bed|awk '{print $1}')
echo $Reads  $totalReads 
echo '==> FRiP value:' $(bc <<< "scale=2;100*$Reads/$totalReads")'%'
done

Fraction of reads in peaks (FRiP) - Fraction of all mapped reads that fall into the called peak regions, i.e. usable reads in significantly enriched peaks divided by all usable reads. In general, FRiP scores correlate positively with the number of regions. (Landt et al, Genome Research Sept. 2012, 22(9): 1813–1831)

文章其它指標：https://www.nature.com/articles/sdata2016109/tables/4

可以使用R包看不同peaks文件的overlap情況。

if(F){
  options(BioC_mirror="https://mirrors.ustc.edu.cn/bioc/") 
  options("repos" = c(CRAN="https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/CRAN/"))
  source("http://bioconductor.org/biocLite.R") 

  library('BiocInstaller')
  biocLite("ChIPpeakAnno")
  biocLite("ChIPseeker")
  
}

library(ChIPseeker)
library(ChIPpeakAnno)
list.files('project/atac/peaks/',"*.narrowPeak")
tmp=lapply(list.files('project/atac/peaks/',"*.narrowPeak"),function(x){
  return(readPeakFile(file.path('project/atac/peaks/', x))) 
})

ol <- findOverlapsOfPeaks(tmp[[1]],tmp[[2]])
png('overlapVenn.png')
makeVennDiagram(ol)
dev.off()

也可以使用專業軟件，IDR 來進行計算出來，同時考慮peaks間的overlap，和富集倍數的一致性 。

source activate atac
# 可以用search先進行檢索
conda search idr
source  deactivate
## 保證所有的軟件都是安裝在 wes 這個環境下面
conda  create -n py3 -y   python=3 idr
conda activate py3
idr -h 
idr --samples  2-cell-1_peaks.narrowPeak 2-cell-2_peaks.narrowPeak  --plot

結果如下：

Initial parameter values: [0.10 1.00 0.20 0.50]
Final parameter values: [0.00 1.06 0.64 0.87]
Number of reported peaks - 5893/5893 (100.0%)

Number of peaks passing IDR cutoff of 0.05 - 674/5893 (11.4%)

參考：https://www.biostat.wisc.edu/~kendzior/STAT877/SLIDES/keles3.pdf

第6步，deeptools的可視化

具體仍然是見：https://mp.weixin.qq.com/s/a4qAcKE1DoukpLVV_ybobA 在ChiP-seq 講解。

首先把bam文件轉為bw文件，詳情：http://www.bio-info-trainee.com/1815.html

cd  ~/project/atac/new
source activate atac
#ls  *.bam  |xargs -i samtools index {} 
ls *last.bam |while read id;do
nohup bamCoverage -p 5 --normalizeUsing CPM -b $id -o ${id%%.*}.last.bw & 
done 

cd dup 
ls  *.bam  |xargs -i samtools index {} 
ls *.bam |while read id;do
nohup bamCoverage --normalizeUsing CPM -b $id -o ${id%%.*}.rm.bw & 
done

查看TSS附件信號強度：

## both -R and -S can accept multiple files 
mkdir -p  ~/project/atac/tss
cd   ~/project/atac/tss 
source activate atac
computeMatrix reference-point  --referencePoint TSS  -p 15  \
-b 10000 -a 10000    \
-R /public/annotation/CHIPseq/mm10/ucsc.refseq.bed  \
-S ~/project/atac/new/*.bw  \
--skipZeros  -o matrix1_test_TSS.gz  \
--outFileSortedRegions regions1_test_genes.bed

##     both plotHeatmap and plotProfile will use the output from   computeMatrix
plotHeatmap -m matrix1_test_TSS.gz  -out test_Heatmap.png
plotHeatmap -m matrix1_test_TSS.gz  -out test_Heatmap.pdf --plotFileFormat pdf  --dpi 720  
plotProfile -m matrix1_test_TSS.gz  -out test_Profile.png
plotProfile -m matrix1_test_TSS.gz  -out test_Profile.pdf --plotFileFormat pdf --perGroup --dpi 720 

### 如果要批處理 ，需要學習好linux命令。

下載 bed文件：https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables 只需要3列坐標格式文件。

查看基因body的信號強度

source activate atac
computeMatrix scale-regions  -p 15  \
-R /public/annotation/CHIPseq/mm10/ucsc.refseq.bed  \
-S ~/project/atac/new/*.bw  \
-b 10000 -a 10000  \
--skipZeros -o matrix1_test_body.gz
plotHeatmap -m matrix1_test_body.gz  -out ExampleHeatmap1.png 

plotHeatmap -m matrix1_test_body.gz  -out test_body_Heatmap.png
plotProfile -m matrix1_test_body.gz  -out test_body_Profile.png

ngsplot也是可以的。

第7步，peaks注釋

統計peak在promoter，exon，intron和intergenic區域的分布
?著作權歸作者所有,轉載或內容合作請聯系作者
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    正文 我和宋清朗相戀三年，在試婚紗的時候發現自己被綠了。 大學時的朋友給我發了我未婚夫和他白月光在一起吃飯的照片。...
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    正文 年R本政府宣布，位于F島的核電站，受9級特大地震影響，放射性物質發生泄漏。R本人自食惡果不足惜，卻給世界環境...
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    文/蒼蘭香墨 我抬頭看了看天上的太陽。三九已至，卻和暖如春，著一層夾襖步出監牢的瞬間，已是汗流浹背。 一陣腳步聲響...
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  • 情欲美人皮
    我被黑心中介騙來泰國打工， 沒想到剛下飛機就差點兒被人妖公主榨干…… 1. 我叫王不留，地道東北人。 一個月前我還...
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    正文 我出身青樓，卻偏偏與公主長得像，于是被迫代替她去往敵國和親。 傳聞我的和親對象是個殘疾皇子，可洞房花燭夜當晚...
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