最近跑通了一遍GWAS分析，全程在linux操作，雖然具體還有好多需要微調的地方，先把代碼整理分享出來mark一下
前期準備
1.理論知識
強烈推薦百邁客云課堂課程GWAS生物信息培訓課程?
或者可以看看我的gwas相關文章
GWAS基本分析內容?（課程學習筆記）
常用GWAS統計方法和模型簡介?（課程學習筆記）
臨床生物信息學中的GWAS分析?（內附擴展閱讀）
精細定位——降低 GWAS的復雜度?（文獻研讀）
2.數據下載
如果你沒有自己的數據又想做gwas分析的話，可以選擇3000水稻基因組的http://snp-seek.irri.org/數據庫直接下載，vcf、表型數據甚至plink bed/bim/fam文件直接下載，gwas結果也做到了可視化
另外推薦華農謝為博團隊開發的這個網站?http://ricevarmap.ncpgr.cn/v2/?非常好用，提供數據下載和gwas可視化結果）
基因型數據可以根據bioproject accession編號從NCBI上下載：
表型數據直接從網站上以excel或csv格式導出：
533份樣品下載和比對挺耗時和占內存的，建議保留bam文件，其他的包括fastq（由bam能轉成fq）、中間文件都可以刪掉，數據過濾質控很快，整個項目做下來大概耗時一個多月吧
第一步 SNP calling
需要安裝的軟件：BWA和GATK/samtools
一、BWA比對
1.構建index
bwa index -a is ref.fa ?或bwa index -a bwtsw ref.fa (>2G)
samtools faidx ref.fa
java -jar $picard/CreatSequenceDictionary.jar R=ref.fa O=ref.dict
2.每個樣分別比對到參考基因組
bwa mem? -t 5? -M -R "@RG\tID:A\tSM:A" ref.fa? A1_1.fq A1_2.fq > A1.sam ?&
bwa mem? -t 5? -M -R "@RG\tID:A\tSM:A" ref.fa? A2_1.fq A2_2.fq > A2.sam ? & ? ? 以此類推.......（-M 將shorter split hits標記為次優，可以兼容Picard．-R 每個標記號需不同，方便后面合并）
3.SortSam
java -jar $picard/SortSam.jar I=A.sam O=A1.sort.bam SO=coordinate
4.MarkDuplicates
java -jar $picard/MarkDuplicates.jar I=A1.sort.bam O=A1.Mark.bam M=A1.metrics?
二、SNP檢測
1.RealignerTargetCreator
java -jar $GATK -R $ref -T RealignerTargetCreator -I A1.Mark.bam -o A1.realign.interval_list
2.IndelRealigner
java -jar $GATK -R $ref -T IndelRealigner -I A1.Mark.bam? -o A1.realn.bam -targetIntervals A1.realign.interval_list
3.HaplotypeCaller
?java -jar $GATK -T HaplotypeCaller -R $ref -ERC GVCF -I A1.realn.bam? ? ? --variant_index_type LINEAR --variant_index_parameter 128000 ? ? -o A1.gvcf
4.CombineGVCFs
?java -jar $GATK -T CombineGVCFs -R $ref --disable_auto_index_creation_and_locking_when_reading_rods --variant A1.gvcf?A2.gvcf?A3.gvcf??.... ? -o combine.gvcf ?(這一步需要把每個樣品的gvcf合并)
5.GenotypeGVCFs
java? -jar $GATK -T GenotypeGVCFs -nt 4 -R $ref --disable_auto_index_creation_and_locking_when_reading_rods? ? -o test_final.vcf --variant combine.gvcf
第二步 基因型填補
需要安裝的軟件：Tassel/beagle等
1. tassel (-LDKNNilmputationPlugin參數有誤，沒有跑成功, 有朋友指出LDKNNi后面是大寫的i，不是小寫的L,以后再試試)
perl /home/user/soft/tassel_v5/run_pipeline.pl -Xms512m -Xmx5g -importGuess ?test_final.vcf -LDKNNiImputationPlugin -highLDSSites 50 -knnTaxa 10 -maxLDDistance 100000000 -endPlugin -export test.imputed.vcf -exportType VCF
2.beagle
java -jar beagle.08Jun17.d8b.jar gt=test_final.vcf?out=test.imputed.vcf
第三步 數據篩選及格式轉換
需要安裝的軟件：plink等
1.按MAF>0.05和缺失率<0.1過濾
/home/user/soft/plink --vcf test.imputed.vcf --maf 0.05 --geno 0.1 --recode vcf-iid --out test.filter --allow-extra-chr （非數字染色體號ChrUn/Sy用此參數, 建議盡量把染色體號轉成數字，另外需要對vcf中的標記ID進行編號）
2.對標記進行LD篩選
/home/user/soft/plink --vcf test.filter.vcf --indep-pairwise 50 10 0.2 --out test.filterLD --allow-extra-chr （.in文件里是入選的標記id）
3.提取篩選結果
/home/user/soft/plink --vcf test.filterLD.vcf --make-bed --extract test.filter.in --out? test.filter.prune.in
4.轉換成structure/admixture格式
/soft/plink --bfile test.filter.prune.in --recode structure --out test.filter.prune.in ?#生成. recode.strct_in為structure輸入格式
/soft/plink --bfile test.filter.prune.in --recode 12 --out test.filter.prune.in ?#生成.ped為admixture輸入格式
第四步 群體結構
需要安裝的軟件：structure/admixture等
這里我選了比較簡單admixture來做 k值范圍1到13
/soft/admixture_linux-1.3.0/admixture --cv test.filter.ped 1 >>log.txt
/soft/admixture_linux-1.3.0/admixture --cv test.filter.ped 2 >>log.txt
.......
/soft/admixture_linux-1.3.0/admixture --cv test.filter.ped 13 >>log.txt
wait
grep "CV error" log.txt >k_1to13
取CV error最小時的k值=10, ?其中test.filter.prune.in.10.Q結果文件作為關聯分析的輸入源文件（去掉最后一列 添加表頭和ID）
第五步 親緣關系/PCA(選做)
需要安裝的軟件: tassel等（ PCA分析可以用R包，已經做了群體結構這里就沒做PCA分析）
perl?/tassel_v5/run_pipeline.pl -importGuess test_impute.vcf -KinshipPlugin ?-method Centered_IBS -endPlugin -export test_kinship.txt -exportType SqrMatrix
第六步 關聯分析
需要安裝的軟件: tassel/GAPIT/FaSt-LMM等（ GAPIT很強大，要裝很多R包，自動做圖可視化。FaSt-LMM以后打算嘗試一下）
輸入文件的格式需要手動修改一下，也比較簡單 (如圖)
1.vcf轉hapmap格式
perl /tassel_v5/run_pipeline.pl -fork1 -vcf test.imputed.vcf? -export test -exportType Hapmap -runfork1
2.SNP位點排序
perl /tassel_v5/run_pipeline.pl -SortGenotypeFilePlugin -inputFile test.hmp.txt? -outputFile test_sort -fileType Hapmap
得到test.hmp.txt
3. GLM模型
perl /tassel_v5/run_pipeline.pl -fork1 -h test_sort.hmp.txt -fork2 -r test.trait.txt -fork3 -q test.best_k10.txt -excludeLastTrait -combine4 -input1 -input2 -input3 -intersect -glm -export test_glm -runfork1 -runfork2 -runfork3
4.MLM模型
perl /tassel_v5/run_pipeline.pl -fork1 -h test_sort.hmp.txt -fork2 -r test.trait.txt -fork3 -q test.best_k10.txt -excludeLastTrait -fork4 -k test_kinship.txt -combine5? -input1 -input2 -input3 -intersect -combine6 -input5 -input4 -mlm -mlmVarCompEst P3D -mlmCompressionLevel None -export test_mlm -runfork1 -runfork2 -runfork3
最后得到關聯分析的結果文件，喜大普奔！
當然GWAS分析需要根據實際項目材料的需要，靈活地選擇分析方法，理解統計學、群體遺傳學等原理，認識GWAS的特點和局限性還是很有必要的。這里只是簡單地在linux上跑通了一遍常用的流程，有很多R包MVP，GAPIT等等可以做并且一鍵出圖如CMplot～有很多不懂的地方需要多學習，畢竟大牛都是自己手動寫腳本來分析，不怎么用軟件的。。/(ㄒoㄒ)/
其他參考：http://blog.sina.com.cn/s/blog_83f77c940102w3d2.html
https://wenku.baidu.com/view/efdb4115a2161479171128e9.html
