作者通過(guò)整合分析scRNA-seq數(shù)據(jù)、公開發(fā)表的scRNA-seq和bulk RNA-seq數(shù)據(jù)集、空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、FACS、IF和免疫治療的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，證實(shí)FAP+成纖維細(xì)胞和SPP1+巨噬細(xì)胞的相互作用參與形成促結(jié)締組織增生性TME，阻止淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，可能導(dǎo)致腫瘤免疫治療抵抗，可以作為結(jié)直腸癌治療的潛在靶點(diǎn)。
1. A single-cell transcriptomic atlas of paired human normal mucosa and CRC tissues.
作者對(duì)5名非轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的腫瘤樣本和鄰近正常組織進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序，經(jīng)質(zhì)控后獲得54103個(gè)細(xì)胞，共分為9種細(xì)胞類型。9種細(xì)胞類型在5例患者的腫瘤和癌旁組織中都有，但每種主要細(xì)胞類型的浸潤(rùn)性程度不同，可能反映了結(jié)直腸癌進(jìn)展階段的差異。
2. Characteristics of cell populations in tumor tissues from CRC patients reveals hallmark signatures of TME and prediction of clinical outcome.
Fig 2a：隨后作者探究了這些細(xì)胞亞群相關(guān)調(diào)控通路基因的表達(dá)情況。作者使MsigDB數(shù)據(jù)庫(kù)中的hallmark基因集來(lái)分析腫瘤組織和鄰近正常組織之間細(xì)胞通路的變化。結(jié)果顯示與正常組織相比，腫瘤組織中的免疫相關(guān)途徑，包括炎癥反應(yīng)、IL2/STAT5信號(hào)和IL6/JAK/STAT3信號(hào)，不僅在免疫細(xì)胞群（(如髓系細(xì)胞和T/ILC細(xì)胞）中富集，在MSC和ECs在腫瘤組織中也富集，提示MSCs和ECs也參與抵抗結(jié)直腸癌的免疫反應(yīng)。
與正常樣本相比，腫瘤的MSC、ECs和髓系細(xì)胞中缺氧的標(biāo)志基因集更豐富。這些特征可能反映了腫瘤缺氧區(qū)域基質(zhì)細(xì)胞的相互作用，將巨噬細(xì)胞、MSC和ECs連接起來(lái)，重塑CRC微環(huán)境。
做法參考分組水平GSVA和批量GSEA和GSVA分析，把熱圖畫成氣泡圖就行了。
由于單細(xì)胞樣本數(shù)有限，作者納入了14個(gè)數(shù)據(jù)集，包括TCGA中的 COAD and READ 隊(duì)列和GEO中12個(gè)獨(dú)立的CRC隊(duì)列。隨后作者使用CIBERSORT用自己的單細(xì)胞數(shù)據(jù)對(duì)這14個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行了反卷積。
Fig 2b：反卷積之后作者做了不同細(xì)胞類型比例相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)不同數(shù)據(jù)集中Myeloid cell和MSCs (間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞) 都存在100%的正相關(guān)。
這個(gè)思路好哎??
Fig 2c：14個(gè)數(shù)據(jù)集的Myeloid cell和MSCs相關(guān)性展示。
Fig 2d：并且作者還發(fā)現(xiàn)MSC浸潤(rùn)程度較高的CRC患者與較差的overall survival (OS)和progression-free survival (PFS)相關(guān)，髓系細(xì)胞浸潤(rùn)程度高同樣與較差的OS和PFS相關(guān)。
3. Tumor-specific FAP+ fibroblasts are associated with colorectal cancer progression.
Fig 3a-c：MSCs和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞被認(rèn)為是調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生和癌癥進(jìn)展的關(guān)鍵基質(zhì)細(xì)胞類型。結(jié)合前面發(fā)現(xiàn)的MSCs與不良預(yù)后相關(guān)，作者對(duì)MSC進(jìn)行了亞群細(xì)分，得到10個(gè)亞型。其中FAP+成纖維細(xì)胞在腫瘤組織中顯著升高。(FAP是活化成纖維細(xì)胞的marker，參考CAR T cells produced in vivo to treat cardiac injury)
Fig 3d, e：公共數(shù)據(jù)集也顯示腫瘤樣本的FAP+成纖維細(xì)胞顯著升高，且與較差的PFS相關(guān)。
Fig 3f, g：隨后作者結(jié)合了每個(gè)細(xì)胞群的高表達(dá)基因，使用流式對(duì)前面的結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，驗(yàn)證了腫瘤組織中FAP+成纖維細(xì)胞的顯著升高。
Fig 3h：隨后作者使用velocity探究了FAP+成纖維細(xì)胞的來(lái)源，發(fā)現(xiàn)它主要由FGFR2+ fibroblasts 或 ICAM1+ telocytes分化而來(lái)。
Fig 3i-l：隨后作者使用SCENIC對(duì)MSCs進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)FAP+成纖維細(xì)胞主要受TWIST1等的調(diào)控。
Fig 3m：Hif1a通路在FAP+成纖維細(xì)胞中也存在顯著激活。
4. Tumor-specific SPP1+ macrophages are associated with CRC progression.
和Fig3的分析思路一模一樣
作者對(duì)髓系細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)分，得到9種亞型。比例變化結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞主要存在于腫瘤組織中，而DC在相鄰正常組織中富集。
值得注意的是，SPP1+巨噬細(xì)胞是腫瘤特異性巨噬細(xì)胞，占腫瘤樣本中髓系細(xì)胞的11.6%，但僅占相鄰正常組織中髓樣細(xì)胞的0.68%。
TCGA和GSE17536CRC隊(duì)列中，SSP1+巨噬細(xì)胞高浸潤(rùn)患者具有更短的PFS。分化軌跡結(jié)果表明腫瘤特異性SPP1+巨噬細(xì)胞可能起源于THBS1+巨噬細(xì)胞。調(diào)節(jié)因子分析結(jié)果表示SPP1+巨噬細(xì)胞主要受到STAT1的調(diào)節(jié)。
此外，SPP1+巨噬細(xì)胞也受到HIF-1信號(hào)通路的調(diào)節(jié) (Supplementary Fig. 6h, i)。由于FAP+成纖維細(xì)胞和SPP1+巨噬細(xì)胞都與缺氧誘導(dǎo)的通路密切相關(guān)，作者推測(cè)在腫瘤的缺氧區(qū)域可能存在一個(gè)基質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)將巨噬細(xì)胞和MSC連接起來(lái)，共同促進(jìn)CRC微環(huán)境的惡化。
5. High infiltration of FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages correlates with worse patient survival.
Fig 5a：作者利用CIBERSORTx在14個(gè)獨(dú)立的CRC隊(duì)列中分析scRNA-seq鑒定到的58個(gè)細(xì)胞類型的浸潤(rùn)狀態(tài)，結(jié)果驗(yàn)證FAP+成纖維細(xì)胞和SPP1+巨噬細(xì)胞相關(guān)性最高。（和Fig2a的區(qū)別是那個(gè)做的是細(xì)胞大群的相關(guān)性，這里做的是所有細(xì)胞亞群的相關(guān)性。）
Fig 5b：在FAP+成纖維細(xì)胞和SPP1+巨噬細(xì)胞不同浸潤(rùn)水平的患者中，二者浸潤(rùn)均較高的患者(FAP+High_SPP1+High)PFS最短，提示這兩種細(xì)胞類型可以協(xié)同促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。
Fig 5c：與FAP+Low_SPP1+Low相比，F(xiàn)AP+High_SPP1+High樣本顯著富集到內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、缺氧、TNF-a和IL-6信號(hào)通路。
Fig 5d-e：腫瘤樣本的FAP和SPP1表達(dá)均增加。
Fig 5f-h：SPP1和FAP的高表達(dá)均與較差的OS和PFS相關(guān)。
Fig 5i-j：免疫熒光結(jié)果顯示腫瘤組織中FAP和SPP1的表達(dá)均特異性增加。且CRC組織中SPP1陽(yáng)性和FAP陽(yáng)性細(xì)胞細(xì)胞在空間上非常接近，提示二者之間可能存在相互作用。
6. Cell–cell interaction of FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages revealed by spatial transcriptomics.
為了得到更多的空間信息，作者對(duì)五例檢測(cè)了單細(xì)胞的患者中的四例的腫瘤組織進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。
Fig 6a-c是Patient6的組織，聚類得到10個(gè)cluster。Fig 6a-c是Patient7的組織，聚類得到6個(gè)cluster (P8和P7一樣是6個(gè)cluster)。P9聚類得到8個(gè)cluster(Supplementary Fig. 9d–f)。
Fig 6a-k：結(jié)果顯示大多數(shù)FAP+成纖維細(xì)胞和SPP1+巨噬細(xì)胞存在共定位，并包裹惡性上皮細(xì)胞(i)。
Fig 6l：FAP+成纖維細(xì)胞和SPP1+巨噬細(xì)胞中促結(jié)締組織增生結(jié)構(gòu)形成的途徑高度活躍，包括細(xì)胞外基質(zhì)組織、膠原纖維組織和對(duì)TGF-β的反應(yīng)。這些現(xiàn)象表明這兩種類型細(xì)胞之間可能存在物理相互作用，并可能調(diào)節(jié)促結(jié)締組織增生的微環(huán)境以限制免疫細(xì)胞浸潤(rùn)至腫瘤核心。
Fig 6m：T細(xì)胞和B細(xì)胞被排斥在腫瘤區(qū)域以外。
7. FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages interaction may contribute to desmoplastic tumor microenvironment.
為了探究CRC患者中FAP+成纖維細(xì)胞和SPP1+巨噬細(xì)胞互作時(shí)的關(guān)鍵調(diào)控分子，作者使用NicheNet探究了FAP+成纖維細(xì)胞和SPP1+巨噬細(xì)胞之間的機(jī)制。
Fig 7a：作者發(fā)現(xiàn)FAP+成纖維細(xì)胞可以通過(guò)COL1A1/LAMA1- ITGB1受體配體對(duì)和SPP1+巨噬細(xì)胞相互作用。此外，F(xiàn)AP+成纖維細(xì)胞通過(guò)TGF-β超家族基因TGFB1和INHBA的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)SPP1+巨噬細(xì)胞的促炎活性，TGF-β可以誘導(dǎo)SPP1+巨噬細(xì)胞中ACVRL1、ACVR1或ACVR1B的表達(dá)。
FAP+成纖維細(xì)胞還可以通過(guò)WNTSA-FZD2和CCL3-CCR5互作增強(qiáng)SPP1+巨噬細(xì)胞的招募。此外，F(xiàn)AP+成纖維細(xì)胞和SPP1+巨噬細(xì)胞還可以通過(guò)RARRES2-CMKLR1進(jìn)行互作。
Fig 7b, c：RARRES2在FAP+成纖維細(xì)胞中高表達(dá)，而CMKLR1(編碼chemerin的受體) 在SPP1+巨噬細(xì)胞和THBS1+巨噬細(xì)胞中都存在高表達(dá)。前面velocity的結(jié)果提示THBS1+巨噬細(xì)胞可能是SPP1+巨噬細(xì)胞的來(lái)源，因此RARRES2-CMKLR1可能驅(qū)動(dòng)THBS1+巨噬細(xì)胞向SPP1+巨噬細(xì)胞分化。
Fig 7d：CRC患者的chemerin高于正常對(duì)照。
Fig 7e-h：NicheNet的結(jié)果顯示，SPP1+巨噬細(xì)胞高表達(dá)細(xì)胞因子TGFB1、IL1A和IL1B，可與FAP+成纖維細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合，促使多種編碼膠原和基質(zhì)金屬蛋白酶基因靶點(diǎn)的表達(dá)。
Fig 7i：對(duì)targets的KEGG通路富集結(jié)果顯示這些靶點(diǎn)參與多種促炎和ECM增生通路。
Fig 7j：最后作者構(gòu)建了top3的ligand（TGFB1, IL1B, IL1A）和ECM-related targets的互作網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)了40個(gè)下游regulators, 包括HIF1A, AKT1, STAT1 和 NFKB1。這些靶點(diǎn)是促結(jié)締組織增生反應(yīng)的重要組成部分，其中大部分參與ECM通路。
綜上，F(xiàn)AP+成纖維細(xì)胞和SPP1+巨噬細(xì)胞形成一個(gè)相互作用的網(wǎng)絡(luò)，支持彼此的維持和功能。這兩種細(xì)胞類型可能在ECM重塑中發(fā)揮重要作用，可能促進(jìn)TME促纖維增生區(qū)的形成。
8. High infiltration of FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages correlates with immunotherapy resistance.
最后作者分析了具有不同F(xiàn)AP+成纖維細(xì)胞和/或SPP1+巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)模式的腫瘤的局部免疫特征。
結(jié)果顯示FAP+High_SPP1+High的腫瘤樣本表現(xiàn)相對(duì)高比例的非同義突變和單核苷酸變異（SNV) 預(yù)測(cè)的新生抗原，并且具有較高的香農(nóng)嫡指數(shù)和TCR豐富度，說(shuō)明T細(xì)胞對(duì)新抗原的無(wú)效反應(yīng)。
在所有CRC亞型中，該亞型的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)最低，表明該特定類型腫瘤的微環(huán)境特征是免疫排斥型的。
采用IMvigor210公共數(shù)據(jù)集分析預(yù)后相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AP或SPP1表達(dá)水平高的患者以及FAP和SPP1表達(dá)都高的患者具有更短的OS。相比FAP+Low_SPP1+Low的患者，F(xiàn)AP或SPP1High的患者表現(xiàn)出較低的應(yīng)答，和更多的疾病進(jìn)展(PD)，這表明FAP或SPP1高表達(dá)的患者對(duì)抗PD-L1治療的應(yīng)答明顯低于其他患者。
FAP或SPP1表達(dá)水平高的患者以及FAP和SPP1表達(dá)都高的患者具有更短的OS。相比FAP和SPP1低表達(dá)的患者，F(xiàn)AP或SPP1高表達(dá)的患者表現(xiàn)出較低的應(yīng)答，和更多的疾病進(jìn)展(PD),SPP1高表達(dá)的患者對(duì)抗PD-L1治療的應(yīng)答明顯低于其他患者。
模式圖
1.研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)整合分析scRNA-seq數(shù)據(jù)、公開發(fā)表的scRNA-seq和bulkRNA-seq數(shù)據(jù)集、空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、FACS、IF和免疫治療的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，本研究提供了單細(xì)胞分辨率下的配對(duì)的腫瘤和癌旁正常組織綜合的TME景觀圖。
2.與癌旁組織相比，結(jié)直腸癌組織特異性富集FAP+fibroblasts及SPP1+macrophages，并通過(guò)CIBERSORTx對(duì)多個(gè)結(jié)腸癌數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)胞浸潤(rùn)程度高度相關(guān)。
3.研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步使用空間轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)存在同時(shí)表達(dá)這兩種細(xì)胞特征基因的聚類，這一聚類的空間位置和細(xì)胞外基質(zhì)的形成高度相關(guān)，提示FAP+fibroblasts和SPP1+macrophages在腸癌中的空間定位上也接近，并圍繞腫瘤中心形成"墻壁"樣的腫瘤邊界。
4.最終證實(shí)FAP+成纖維細(xì)胞和SPP1+巨噬細(xì)胞的相互作用參與形成促結(jié)締組織增生性TME，阻止淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，可能導(dǎo)致腫瘤免疫治療抵抗，可以作為CRC治療的潛在靶點(diǎn)。
