Complex interactions between potentially pathogenic,opportunistic, and resident bacteria emerge during infection on a reef-building coral

在造礁珊瑚的感染過程中，潛在致病性、機會性和常駐細菌之間出現復雜的相互作用

患病珊瑚上細菌多樣性的增加會使疾病的病因學變得模糊，并使我們對發病機制的理解變得復雜。為了從微生物對疾病的反應中分離出可能導致白帶病徵的微生物，我們給健康的珊瑚接種了來自明顯患病珊瑚的感染劑量。我們對這些受劑量影響的珊瑚和健康對照進行了采樣，以便對細菌16S區進行測序。內生蟲單胞菌與4/10個菌落的健康樣本有關，在給藥前占據微生物群落的主導地位，而且只有在表現出疾病跡象的珊瑚中，內生蟲單胞菌數量才會隨著時間的推移而減少，這表明內生蟲單胞菌在抵抗疾病方面發揮了作用。我們將與疾病相關的細菌按照數量增加的時間(初級細菌vs次級細菌)以及它們是來自劑量(殖民者)還是來自以前健康的珊瑚(反應者)進行分類。我們發現，不論最終的疾病狀況如何，所有受劑量影響的珊瑚體內的初級反應者都有所增加，因此不太可能導致疾病跡象。相比之下，巴斯德氏菌科和Francisellaceae科的主要定殖菌僅在劑量較大的珊瑚中增加，這些珊瑚最終出現了疾病跡象，可能是與疾病跡象發育有關的外來感染性細菌。我們不再對患病和健康的細菌群落進行靜態比較，而是提供了一個框架來識別其他珊瑚疾病中的關鍵角色。

關鍵詞:

珊瑚疾病;白色帶疾病;鹿角珊瑚;發病機理;共生微生物

簡介

海洋無脊椎動物是一些最廣泛研究和復雜細菌共生的家園。深海熱液噴管蠕蟲(Riftia pachyptila)缺乏口或內臟，而是從含有化學自養細菌的特殊器官獲取營養。短尾烏賊Euprymna scolopes還為其細菌共生菌fischeri開發了一種特殊的器官，使其能夠發出生物熒光。隨著我們更多地了解這些互惠關系，我們也更好地理解病原體和有益共生體之間的連續性。理論認為一些有益的細菌最初可能是病原體，隨著宿主的進化而增強宿主的適應性。最近，深海貽貝硫氧化有益共生體的基因組被發現含有編碼毒力基因的毒素同源體，使我們對病原體和毒力的認識復雜化。近年來，所描述的海洋疾病及其影響的數量迅速增加，導致了關鍵海洋生態系統的崩潰。動物流行病增加的部分原因可能是由于人為因素和氣候變化導致海洋細菌-動物關系的變化。由于農業徑流和向藻類占主導地位的生態系統的轉變，沿海海洋生態系統和周圍海水日益飽和，微生物從氣溫上升和可用營養物質增加中獲利。這種微生物豐富度的增加，加上以前良性細菌的行為和基因調節變化，對疾病和共生有了明確的定義。為了了解并最終控制這些新的外生動物，我們需要研究與海洋動物有關的細菌群落是如何變化的，作為疾病的起因和對疾病的反應:在有益的、互惠的和致病的關系之間進行轉換。
白帶病(WBD)是一種傳染性疾病，目前已導致兩種加勒比頂孔珊瑚種群大量死亡。頂孔珊瑚是一種生長迅速的造礁珊瑚，為許多魚類和無脊椎動物(包括生長較慢的珊瑚)創造了棲息地。WBD的特征是壞死組織的前部，從珊瑚群的基部到頂端迅速移動，留下一條帶白色的骨骼。WBD可通過水柱和珊瑚蟲傳播。多項研究證實，WBD征象可能是由疾病漿液中的細菌部分引起，并通過抗生素的給藥而抑制，提示該病是由細菌引起的。研究表明，charchariae弧菌能夠在波多黎各的a . cervicornis中誘發WBD信號，而一種可能危及宿主的類似立克次氏體的有機體，與表面上健康的a . cervicornis和表現出疾病信號的a . cervicornis都有關聯。這些細菌和其他細菌如何促進WBD癥狀的發展，以及是否在整個加勒比地區和整個時間內存在一種單一的主要WBD病原體，目前尚不清楚。白帶病(WBD)是一種傳染性疾病，目前已導致兩種加勒比頂孔珊瑚種群大量死亡。頂孔珊瑚是一種生長迅速的造礁珊瑚，為許多魚類和無脊椎動物(包括生長較慢的珊瑚)創造了棲息地。WBD的特征是壞死組織的前部，從珊瑚群的基部到頂端迅速移動，留下一條帶白色的骨骼。WBD可通過水柱和珊瑚蟲傳播。WBD可通過水柱和珊瑚蟲傳播。多項研究證實，WBD征象可能是由疾病漿液中的細菌部分引起，并通過抗生素的給藥而抑制，提示該病是由細菌引起的。多項研究證實，WBD征象可能是由疾病漿液中的細菌部分引起，并通過抗生素的給藥而抑制，提示該病是由細菌引起的。研究表明，charchariae弧菌能夠在波多黎各的a . cervicornis中誘發WBD信號，而一種可能危及宿主的類似立克次氏體的有機體，與表面上健康的a . cervicornis和表現出疾病信號的a . cervicornis都有關聯。這些細菌和其他細菌如何促進WBD癥狀的發展，以及是否在整個加勒比地區和整個時間內存在一種單一的主要WBD病原體，目前尚不清楚。
Gignoux-Wolfsohn和Vollmer(2015)利用16S基因序列發現wwd相關菌群與健康珊瑚有顯著差異。與其他珊瑚疾病的研究結果一致，我們發現有疾病跡象的珊瑚的細菌群落更加多樣化，與明顯健康的珊瑚相比，與OTUs的聯系更加緊密。缺乏持續健康的相關細菌表明，其他因素可能會削弱這種微生物群。我們還發現，采集地點對微生物群落的影響與珊瑚的不穩定狀態一樣大。在所有位點中發現的許多與疾病相關的OTUs成為許多假定的WBD病原體。
細菌性疾病可能是由單個病原體的幾個細胞侵入宿主組織(低感染劑量)引起的，這是一個病原體聯合體，它可能足以但并非必須引起疾病癥狀或通常共生的細菌達到閾值，從而引發向致病性行為的轉變。此外，共生細菌可能由于外部環境的觸發而致病。圍繞這些情景中的哪些導致類似感染性WBD的跡象的不確定性使得我們確定哪些識別的“疾病相關”OTU可能侵入宿主組織并引起疾病體征并且可能對壞死有反應的能力變得復雜，宿主免疫應答或病原體產生的次級代謝產物。我們在三個時間點，將病珊瑚及樣本珊瑚的組織均質化，并以感染劑量照射珊瑚:(i)照射前表面健康;(ii)照射后表面健康;通過使用多個珊瑚菌落，我們能夠更好地識別與每個菌落相關的寄生微生物，并且通過在受控的容器中進行這個實驗，我們消除了致病性的環境誘因的可能性。通過使用多個珊瑚菌落，我們能夠更好地識別與每個菌落相關的寄生微生物，并且通過在受控的容器中進行這個實驗，我們消除了致病性的環境誘因的可能性。我們檢查了疾病相關的OTUs在兩個站點之間的一致性，以消除我們之前發現的站點變異性。這個受控的感染實驗讓我們能夠回答關于患病的珊瑚微生物群的兩個主要問題:(i)這些疾病相關的細菌從何而來?(二)什么時候它們的數量會增加?我們預計最終的病害珊瑚微生物群落將由來自于劑量(這里稱為定殖器)的細菌和在珊瑚(應答者)上發現的細菌的豐度增加而形成，這些細菌在病征發生前(原發)或發生后(繼發)大量增加。

材料和方法

2014年7月，在巴拿馬博卡斯德爾托羅（位于佛羅里達州）珊瑚礁的兩個地點（CK4和CK14）使用鹿角珊瑚（Acropora cervicornis）建立了感染實驗。在每個地點，通過采集來自5個菌落的12個明顯健康的5厘米碎片（假定為不同的基因型，至少相距10米）的A. cervicornis，共收集10個菌落（菌落）來收集珊瑚。通過從表現出WBD跡象的3個菌落的疾病界面（或等同位置）和來自三個明顯健康的對照菌落的三個重復的5cm片段收集待制成接種物的珊瑚。這些碎片被送往史密森熱帶研究所，并被綁在塑料百葉窗上。將10個片段(每個菌落1個片段)放置在12個帶動力頭的封閉50 L罐(罐)中(實驗設計見圖S1支撐信息)。珊瑚是采樣時放置在水箱(時間)在以下方式:兩個息肉的中間片段(這個小示例使用,以免壓力珊瑚碎片)被用無菌鉗和放置在200年μl硫氰酸胍DNA的緩沖區。鑷子在珊瑚之間用火焰消毒。在整個實驗過程中，為了保持鹽度和體積，加入了去離子水，并測量了溫度，以確保水箱間的一致性。創建12菌劑(三個劑量和三個控制菌劑從每個站點),三個復制碎片從每個殖民地被搖晃的獵鷹管無菌均質玻璃珠和15毫升過濾海水,直到沒有組織保持骨架,然后匯集。二百毫升的變質劑是離心機和保存500年μl DNA的緩沖區。在接種之前，使用噴槍和過濾的海水損壞珊瑚。然后用6mL劑量（接種劑的劑量水平）接種6個罐，每個位點接種3個（接種部位），并且用60mL對照接種物（接種物的對照水平）接種6個罐，每個位點3個（接種物）現場）。然后如上所述在接種后10小時對珊瑚取樣（時間二）。當接種后22小時開始給藥珊瑚開始顯示疾病跡象（即白色病變生長環繞珊瑚并形成特征性白色骨架）時，將它們取樣并從實驗中移除以及相應的對照片段（時間三）。以這種方式繼續取樣，直至接種后60小時，對所有剩余的珊瑚進行取樣（參見圖S1進行取樣）。根據珊瑚是否最終顯示出疾病跡象來確定珊瑚的最終疾病狀態。例如，即使在時間2收集的樣本來自看起來很健康的珊瑚，如果珊瑚在第3時顯示出疾病跡象，那么樣本的最終疾病狀態就會患病。 60只珊瑚中共有43只最終出現疾病跡象。 60只對照珊瑚中的兩只在實驗過程中死亡，并從后續分析中刪除（表S1，支持信息）。
使用Agencourt DNAdvance珠提取試劑盒從樣品中提取DNA，并添加PEB緩沖液。每輪進行空白DNA提取。選擇16S基因的V6高變區作為靶標，因為其長度短，對物種水平多樣性具有高度敏感性。V6區域用引物擴增，該引物由與V6互補的區域，獨特的5堿基對條形碼和Illumina測序接頭組成：V6-L [5′ ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTnnnnnCW ACGCGARGAACCTTACC3 ′]
V6-R [5′ CGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTnnn nnACRACACGAGCTGACGAC3 ′]
使用獨特的引物組合對每個樣品進行單獨的40μlPCR反應：每種4mM引物5μl，8μl標準Taq緩沖液（New England Biolabs，Ipswich，MA，USA），0.8μldNTP，20μldH2 O， 0.5μlTaqDNA聚合酶（NEB）用于以下循環：94°C持續2分鐘，28個循環94°C持續15 s，55°C持續15 s，72°C持續30 s，以72°C結束1分鐘用每組反應擴增陰性對照和空白。使用Qubit 2.0熒光計（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）定量PCR產物的濃度，以確定每種產物的體積。然后用以下Illumina引物擴增合并的PCR產物：OLJ139 [5′ AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTA CACGA3 ′]
OLJ140 [5′ CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCC TGCTGAAC3 ′]

生物信息學

使用FLASH重疊配對讀數（Magoc和Salzberg 2011）。然后使用https://github.com/sagw/Python scripts / blob / master / SD1 / SD1 demultiplex.py上提供的自定義python腳本對序列進行多路分解，質量過濾和修剪。
使用Qiime 1.9.0，使用開放參考OTU揀選方法和使用BLAST針對2015年7月SILVA數據庫分配的分類法挑選97％OTU（Quast等人2013）。使用BLAST鑒定為葉綠體的OTU被除去。使用UCHIME檢測并除去嵌合體（Edgar等人，2011）。有關生物信息學的更多詳細信息，請訪問https://github.com/sagw/Notebooks/tree/master/SD1筆記本。

統計分析

OTU計數在R包DESeq2中使用sizefactors方法進行歸一化，使用算術方法進行歸一化。使用Bray-Curtis異質性的PERMANOVA (package Vegan中的adonis)測試社區水平效應的意義。
兩個PERMANOVAs進行:一個使用公式:‘～ colony’ for time-one samples, and one using the formula: ‘～ fi- nal disease state + inoculant ? site ? time ? inoculant site’對于時間點兩的三個樣本。
為了評價各主要效應之間的單個OTU的豐度變化以及隨機效應的加入對相互作用的影響，將各OTU的豐度數據擬合到擬泊松混合效應廣義線性模型中。
GLMMs時間一樣品用固定效應公式：使用Wald卡方檢驗(pack- age Car的方差分析)(Fox和Weisberg 2011年的方差分析)通過III型方差分析確定效應的顯著性，并對每個主要效應和交互作用確定顯著差異的OTUs (p值通過錯誤發現率調整< 0.05)。然后根據GLMM項的顯著性和事后計算均值對OTUs進行分組，使用ggplot2繪制OTUs子集的平均豐度。

OTU組定義

我們鑒定出有菌落特異性的健康菌群為OTUs，它們在第一時間因菌落的不同而顯著不同，在第二次和第三次因疾病狀態的不同而顯著不同，其豐度控制高于受劑量影響的病珊瑚。這些OTUs大部分屬于內生菌屬，因此，對每個菌落計算每個被鑒定為內生菌的OTU的平均值，并將每個菌落樣品中內生菌占總菌群的百分比作為內生菌組成的百分比的平均值。
我們確定了可能與疾病病因有關的細菌(原發性OTUs)，這些OTUs在珊瑚上大量增加，最終在這些癥狀出現之前就顯示出疾病跡象。我們假設暴露于感染劑量但沒有顯示疾病跡象的珊瑚對疾病具有抵抗力(即減少病原體載量或禁止感染)，因此可能在其微生物群落中不包含與疾病病理有關的OTUs。因此，我們把重點放在了OTUs上，這些OTUs在劑量充足的珊瑚中含量更高，最終顯示出疾病跡象。
如果他們（i）沒有劑量，我們將OTU確定為主要應答者; （ii）及時出現一只珊瑚; （iii）最終疾病狀況在時間上顯著不同 - 兩個和三個珊瑚; （iv）在給藥的患病珊瑚中比對照更豐富; （v）在菌落，位點或位點和接種物的相互作用方面沒有顯著差異。如果OTUs (i)在劑量中沒有出現;(ii)曾經有過珊瑚;(iii)最終病況在時間二和三上有顯著差異;(iv)受劑量影響的病珊瑚數量多于對照組;且(v)在菌落、位點或位點與接種物的相互作用上無顯著差異，我們確定OTUs為主要應答者。
如果（1）劑量比對照孕育劑更豐富; （ii）最終疾病狀態顯著不同; （iii）在兩次和三次時，對照珊瑚的劑量較大; （iv）菌落，位點和孕育劑和接種部位的相互作用沒有顯著差異，我們將OTU鑒定為主要定殖者
次生OTUs在最終的疾病狀態上有顯著的差異，與對照組相比，在第三次而不是第二次用藥時，染病的OTUs數量更多。這些OTUs按科進行分組，并計算出在三次按地點和接種地點分開顯示疾病跡象的劑量珊瑚的平均值。
所有序列都存儲在bioproject ID PRJNA387312下的Read Archive中。分析的進一步細節可以在https://github.com/sagw/r -scripts/tree/master/SD1找到

結果與討論

我們確定了數量不斷變化的OTUs群，這有助于形成典型的患病珊瑚微生物群:與某些珊瑚菌落相關的常駐OTUs(菌落特異性居民)減少，其他常駐OTUs(主要應答者)增加，以及外來細菌的定植(主要定植者)。這種識別海洋動物從健康到可見疾病跡象轉變過程中細菌群的方法可以應用于其他未被充分研究的海洋疾病。

社群水平的影響

對275個樣本進行測序，得到65 413 553個重疊讀序列，得到97 933個OTUs(97%相似度)。注射處理后的珊瑚的細菌群落變得更加多樣化,因為他們表現出疾病癥狀的香農多樣性(從2.13,0.12到4.18,0.19,方差分析,F1, 272 = 52.37, P < 0.001)和稀薄的豐富性(從224.43到402.57,方差分析,F1,272 = 27.95, P < 0.001)(表S2,支持信息)。這一發現與其他關于珊瑚疾病相關細菌群落的研究一致。
在給藥前(第一次)收集的樣本中，細菌群落之間的差異很大(18%)可以用菌落的顯著效應來解釋(PERMANOVA, F9,81 = 1.8, P = 0.001, R2 = 0.18)。對于給藥后采集的樣本(2次、3次)，最終疾病狀態的主要影響，以及時間、接種劑和接種位點的相互作用，顯著影響珊瑚相關菌群(表1)。

內游動單胞菌是健康珊瑚的菌落特異性宿主

不同地點的次級OTUs不一致

結果

患病珊瑚的微生物群落取決于已存在的健康微生物群落、受感染珊瑚的疾病史、疾病的起源和疾病進展的時間。我們的方法允許我們根據細菌數量增加的來源和時間來分離細菌，提供了比以前獨立培養的研究更多的關于細菌可能導致疾病的信息。我們的研究發現，內生單胞菌只與某些珊瑚群落的健康有關，這可能解釋了個別珊瑚對疾病反應的變化。主要反應者，可能是機會主義者，無論最終的疾病狀態如何，都會增加劑量的珊瑚，這一發現否定了一種假說，即頸角頂孔鳥的WBD并不僅僅是機會主義者造成的。我們確定了源自感染劑量的主要定植體，并能夠密切跟蹤其數量的變化，因為珊瑚出現了疾病跡象，確定彎曲桿菌科、弗朗西斯菌科和巴氏桿菌科是最可能的主要病原體。我們的研究結果強調了將時間納入未來海洋疾病研究的重要性，以及觀察單個菌株行為的必要性，而不是僅僅通過更高層次的分類來總結群落的變化。我們的方法可以應用于不屬于一種病原體一種疾病框架的其他海洋疾病，提供對疾病的更全面的理解，并允許在我們不斷變化的海洋氣候中改變病原體的定義。