學習目標：
- 學會用MACS2 call peaks
- 理解MACS2 call peaks的結果
Peak Calling
Peak calling即利用計算的方法找出ChIP-seq或ATAC-seq中reads富集的基因組區域。
如下圖所示，比對結果的文件中reads在正負鏈不均勻分布，但在結合位點聚集。正負鏈5‘末端的reads各形成一組合，通過統計學的方法評估這些組合的分布并和對照組比較，確定這些結合位點是否是顯著的。
NOTE：ChIP-seq的分析方法可以鑒定兩種類型的富集模式：broad domains和narrow peaks。broad domains，如組蛋白修飾在整個基因body區域的分布；narrow peak，如轉錄因子的結合。narrow peak相對于broad 或者分散的marks更易被檢測到。也有一些混合的結合圖譜，如PolII包括narrow和broad信號。
MACS2
peaks calling 有不同的方法，MACS2是最常用的call peaks工具。 MACS全稱Model-based Analysis of ChIP-Seq，最初的設計是用來鑒定轉錄因子的結合位點，但是它也可以用于其他類型的富集方式測序。
MACS通過整合序列標簽位置信息和方向信息提高結合位點的空間分辨率。MACS的工作流如下所示：
MACS2的使用方法
MACS2的用法，call peaks的參數及輸出文件的解讀可以參考MACS2文檔學習。
了解相關參數：
輸入文件參數：
-
-t:實驗組，IP的數據文件 -
c: 對照組 -
f：指定輸入文件的格式，默認是自動檢測輸入數據是什么格式，支持bam,sam,bed等 -
g:有效基因組大小，由于基因組序列的重復性，基因組實際可以mapping的大小小于原始的基因組。這個參數要根據實際物種計算基因組的有效大小。軟件里也給出了幾個默認的-g 值：hs -- 2.7e9表示人類的基因組有效大小(UCSC human hg18 assembly).- hs: 2.7e9
- mm: 1.87e9
- ce: 9e7
- dm: 1.2e8
輸出文件參數：
-
--outdir:輸出結果的存儲路徑
--n:輸出文件名的前綴 -
-B/--bdg:輸出bedgraph格式的文件，輸出文件以NAME+'_treat_pileup.bdg' for treatment data, NAME+'_control_lambda.bdg' for local lambda values from control顯示。
peak calling 參數
-
-q/--qvalue和-p/--pvalue
q value默認值是0.05，與pvalue不能同時使用。 -
--broad
peak有narrow peak和broad peak, 設置時可以call broad peak 的結果文件。 -
--broad-cutoff
和pvalue、以及qvalue相似 -
--nolambda: 不要考慮在峰值候選區域的局部偏差/λ
q值與峰寬有一定的聯系。理想情況下，如果放寬閾值，您將簡單地獲得更多的峰值，但是使用MACS2放松閾值也會導致更寬的峰值。
Shift 模型參數：
-
--nomodel
這個參數和extsize、shift是配套使用的，有這個參數才可以設置extsize和shift。 -
--extsize
當設置了nomodel時，MACS會用--extsize這個參數從5'->3'方向擴展reads修復fragments。比如說你的轉錄因子結合范圍200bp，就設置這個參數是200。 -
--shift
當設置了--nomodel，MACS用這個參數從5' 端移動剪切，然后用--extsize延伸，如果--shift是負值表示從3'端方向移動。建議ChIP-seq數據集這個值保持默認值為0，對于檢測富集剪切位點如DNAsel數據集設置為EXTSIZE的一半。
示例：
- 想找富集剪切位點，如DNAse-seq，所有5'端的序列reads應該從兩個方向延伸，如果想設置移動的窗口是200bp，參數設置如下：
--nomodel --shift -100 --extsize 200 - 對nucleosome-seq數據，用核小體大小的一半進行extsize,所以參數設置如下：
--nomodel --shift 37 --extsize 73
-
--call-summits
MACS利用此參數重新分析信號譜，解析每個peak中包含的subpeak。對相似的結合圖譜，推薦使用此參數，當使用此參數時，輸出的subpeak會有相同的peak邊界，不同的績點和peak summit poisitions.
ATAC-Seq call peaks示例
ATAC-seq關心的是在哪切斷，斷點才是peak的中心，所以使用shift模型，--shift -75或-100
對人細胞系ATAC-seq 數據call peak的參數設置如下：
macs2 callpeak -t H1hesc.final.bam -n sample --shift -100 --extsize 200 --nomodel -B --SPMR -g hs --outdir Macs2_out 2> sample.macs2.log
MACS2輸出文件解讀
-
NAME_peaks.xls
包含peak信息的tab分割的文件，前幾行會顯示callpeak時的命令。輸出信息包含：- 染色體號
- peak起始位點
- peak結束位點
- peak區域長度
- peak的峰值位點（summit position）
- peak 峰值的高度（pileup height at peak summit, -log10(pvalue) for the peak summit）
- peak的富集倍數（相對于random Poisson distribution with local lambda）
Coordinates in XLS is 1-based which is different with BED format
XLS里的坐標和bed格式的坐標還不一樣，起始坐標需要減1才與narrowPeak的起始坐標一樣。
-
NAME_peaks.narrowPeak
*narrowPeak文件是BED6+4格式，可以上傳到UCSC瀏覽。輸出文件每列信息分別包含：- 1；染色體號
- 2：peak起始位點
- 3：結束位點
- 4：peak name
- 5：int(-10*log10qvalue)
- 6 ：正負鏈
- 7：fold change
- 8：-log10pvalue
- 9：-log10qvalue
-
10：relative summit position to peak start（？）
-
NAME_summits.bed
BED格式的文件，包含peak的summits位置，第5列是-log10pvalue。如果想找motif，推薦使用此文件。
Remove the beginning track line if you want to analyze it by other tools.???
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.bdg
bedGraph格式，可以導入UCSC或者轉換為bigwig格式。兩種bfg文件：treat_pileup, and control_lambda. -
NAME_peaks.broadPeak
BED6+3格式與narrowPeak類似，只是沒有第10列。
summits.bed，narrowPeak，bdg, xls四種類型輸出文件的比較：
- xls文件
文件包含信息還是比較多的，和narrowPeak唯一不同的是peak的起始位置需要減1才是bed格式的文件，另外還包含fold_enrichment 和narrowPeak的fold change 對應，-log10pvalue,-log10qvalue,peak長度，peak 峰值位置等。 - narrowPeak文件
和xls文件信息類似 - summits.bed文件
包含峰的位置信息和-log10pvalue - bdg文件
bdg文件適合導入UCSC或IGV進行譜圖可視化，或者轉換為bigwig格式再進行可視化。
為什么染色體號后面會出現其他的字符串？？？？
