我梳理了GWAS全基因組關(guān)聯(lián)分析的整個流程，并提供了基本的命令，用到的軟件包括BWA、samtools、gatk、Plink、Admixture、Tassel等，在此分享出來給大家提供參考。

一、BWA比對

1.構(gòu)建索引

bwa index -a is example.fasta 
#構(gòu)建索引 -a is算法 （BWT構(gòu)造算法：bwtsw、is或rb2）

2.進(jìn)行比對

bwa mem -t 6 -R '@RG\tID:foo\tPL:Illumina\tSM:example' 
example.fasta example_1.fq.gz example_2.fq.gz > example.sam
# 進(jìn)行對比 mem算法 -t 運(yùn)行的核數(shù)目
# -R添加頭部  
ID：這是Read Group的分組ID，一般設(shè)置為測序的lane ID（不同lane之間的測序過程認(rèn)為是獨(dú)立的），下機(jī)數(shù)據(jù)中我們都能看到這個信息的，一般都是包含在fastq的文件名中；
PL：指的是所用的測序平臺，這個信息不要隨便寫，在GATK中，PL只允許被設(shè)置為：ILLUMINA，SLX，SOLEXA，SOLID，454，LS454，COMPLETE，PACBIO，IONTORRENT，CAPILLARY，HELICOS或UNKNOWN這幾個信息。如果不知道，那么必須設(shè)置為UNKNOWN。
SM：樣本ID。
LB：測序文庫的名字，如果上面的lane ID足夠用于區(qū)分的話，也可以不用設(shè)置LB；

（用GATK檢測變異其中ID,PL和SM信息是必須的）

二、samtools格式轉(zhuǎn)換

1.sam格式轉(zhuǎn)換為bam格式

samtools view -bS example.sam -o example.bam 
# -b 輸出bam格式文件 -S 輸入sam格式文件

2.質(zhì)控

samtools view -h -b -q30 example.bam > example.q30.bam
# -q 比對的最低質(zhì)量值 -h 輸出的文件包含頭部信息 -b 輸出bam格式文件

3.構(gòu)建索引

samtools  faidx base/example.fasta  
# 該命令會在example.fasta所在目錄下創(chuàng)建一個example.fai索引文件
gatk CreateSequenceDictionary -R example.fasta -O example.dict
# 創(chuàng)建gatk索引 生產(chǎn)dict文件

三、gatk變異檢測

1.排序

gatk SortSam -I example.q30.bam -O example.q30.sort.bam 
-R base/example.fasta -SO coordinate --CREATE_INDEX true
# -I 輸入文件 -O 輸出文件 -R參考基因組 --CREATE_INDEX 是否建立索引 
將sam文件中同一染色體對應(yīng)的條目按照坐標(biāo)順序從小到大進(jìn)行排序

2.標(biāo)記重復(fù)序列

gatk  MarkDuplicates -I example.q30.sort.bam -O example.q30.sort.markdup.bam -M example.q30.sort.markdup_metrics.txt
# -I 輸入排序后的文件 -O 輸出文件 -M 輸出重復(fù)矩陣

注意：

samtools index example.q30.sort.markdup.bam
# 為gatk建立索引這里非常重要

3.檢測變異

gatk HaplotypeCaller --emit-ref-confidence GVCF -R base/example.fasta -I example.q30.sort.markdup.bam -L chrX -O chrX.g.vcf.gz
# HaplotypeCaller同時檢測snp和indel -R 參考基因組 -I 輸入文件 -L 僅檢測該染色體的變異（分染色體檢測變異，加快速度）-O 輸出文件 
# --sample-ploidy 倍性 默認(rèn)2

合并文件(g.vcf)

gatk CombineGVCFs -R base/example.fasta --variant example1.g.vcf.gz --variant example2.g.vcf.gz -O con.vcf.gz
# -R 參考基因組 --variant 輸入變異文件 可以輸入多個文件 -O 輸出文件

檢測變異

gatk GenotypeGVCFs -R ref.fa -V test.g.vcf -O test.vcf

4.提取SNP變異

gatk SelectVariants -R base/example.fasta -V test.vcf -O test.snp.vcf --select-type-to-include SNP
# -R 參考基因組 -O 輸出vcf文件 -V 輸入vcf文件 --select-type-to-include 選取提取的變異類型(#SNP,MNP,INDEL,SYMBOLIC,MIXED)

5.對SNP進(jìn)行過濾

gatk VariantFiltration -O chr5.Filt.vcf -V chr5.vcf 
--cluster-window-size 10 
--filter-expression "MQ0 >= 4 && ((MQ0 / (1.0 * DP)) > 0.1)" --filter-name "HARD_TO_VALIDATE" 
--filter-expression "DP < 5 " --filter-name "LowCoverage" 
--filter-expression "QUAL < 30.0 " --filter-name "VeryLowQual" 
--filter-expression "QUAL > 30.0 && QUAL < 50.0 " 
--filter-name "LowQual" --filter-expression "QD < 1.5 " 
--filter-name "LowQD" 
# -O 輸出文件 -V輸入變異文件 --filter-expression 過濾條件 --filter-name 被過濾掉的SNP不會刪除，而是給一個標(biāo)簽，例如 "LowCoverage" 。
這里可以將過濾條件合并，僅給出一個標(biāo)簽。--cluster-window-size 以10個堿基為一個窗口

這里通過設(shè)定相應(yīng)的參數(shù)值進(jìn)行了硬過濾，實(shí)際應(yīng)用時還要根據(jù)數(shù)據(jù)類型及自己的需求設(shè)定相應(yīng)的參數(shù)。

6.合并文件(vcf)

刪除掉被過濾的SNP
grep -v "LowCoverage" Filt.vcf > Filt1.vcf
# -v顯示不包含匹配文本的所有行 "LowCoverage"上一步給出的標(biāo)簽
合并成一個文件
gatk MergeVcfs -I chr1.Filt.vcf -I chr2.Filt.vcf -I chr3.Filt.vcf  -O Filt.vcf
# -I 輸入文件 可以多次指定 -O 輸出文件

至此為止就得到了整個群體的VCF變異文件，后續(xù)都是基于此文件來進(jìn)行相應(yīng)的分析。

四、Plink格式轉(zhuǎn)換及主成分分析

1.VCF格式轉(zhuǎn)換為 ped/map格式

vcftools --vcf snp.vcf --plink --out snp

2.ped/map格式轉(zhuǎn)換為bed/bim/fam格式

plink --file snp --make-bed --out snp_test

3.主成分分析

Plink  --threads 8 --bfile snp --pca 10 --out pca
# --threads 線程數(shù) --bfile 輸入.bed文件 --pca 主成分的成分?jǐn)?shù) --out輸出的文件名

五、Admixture 群體結(jié)構(gòu)

1.群體結(jié)構(gòu)分析

 for K in 2 3 4 5 6 7 8 9 10; \
do admixture --cv hapmap3.bed $K | tee log${K}.out; done
#2 3 4 5 6 7 8 9 10分成的群體結(jié)構(gòu)數(shù) hapmap3.bed 輸入文件

注意:
如果你的數(shù)據(jù)格式是plink的bed文件, 比如a.bed, 那么你應(yīng)該包含a.bim, a.fam
如果你的數(shù)據(jù)格式是plink的ped文件, 比如b.ped, 那么你應(yīng)該包括b.map
K值根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行設(shè)置，通過比較得到最佳K值。

grep -h CV log*.out
#查看最佳K值 輸出最佳K值文件：hapmap3.3.Q

2.R語言作圖

tbl=read.table("hapmap3.3.Q")
barplot(t(as.matrix(tbl)), col=rainbow(K),
xlab="Individual", ylab="Ancestry", border=NA)
hapmap.3.Q文件為群體結(jié)構(gòu)的結(jié)果，作為協(xié)變量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析

六、Tassel關(guān)聯(lián)分析

Tassel的管道命令不允許有回車符號，使用以下命令時需要將#注釋及換行刪除。

1.VCF格式轉(zhuǎn)換為 hmp格式

run_pipeline.pl -SortGenotypeFilePlugin -inputFile example.vcf -outputFile example -fileType VCF
#給vcf文件排序，排成tassel認(rèn)可的序列
#-inputFile 輸入的文件名 -outputFile 輸出的文件名 -fileType 輸出的文件格式
run_pipeline.pl -fork1 -vcf example.vcf  -export example -exportType Hapmap -runfork1
#vcf文件轉(zhuǎn)換為hapmap格式
#-vcf 輸出的文件 -export 輸出的文件 -exportType 輸出的文件格式

2.親緣關(guān)系

run_pipeline.pl -importGuess genotype.hmp.txt #打開數(shù)據(jù)文件
-KinshipPlugin -method Centered_IBS -endPlugin #計(jì)算親緣關(guān)系
-export genotype_kinship.txt  #輸出文件名
-exportType SqrMatrix #輸出格式

3.關(guān)聯(lián)分析

混合線性模型

run_pipeline.pl -fork1 -h genotype.hmp.txt -filterAlign -filterAlignMinCount 150 -filterAlignMinFreq 0.05 -filterAlignMaxFreq 1 
#-h讀取hapmap格式的基因型數(shù)據(jù) -filterAlign 打開過濾選項(xiàng) 
#-filterAlignMinCount -filterAlignMinFreq -filterAlignMaxFreq 過濾的條件 需要按照實(shí)際情況進(jìn)行修改
-fork2 -r traits.txt 
#-r 讀取表型數(shù)據(jù)
-fork3 -q population_structure.txt -excludeLastTrait 
#-q 讀取群體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù) -excludeLastTrait 去掉最后一個群體結(jié)構(gòu) （當(dāng)分成的群體結(jié)構(gòu)＞2時）
-fork4 -k kinship.txt 
#讀取親緣關(guān)系數(shù)據(jù)
-combine5 -input1 -input2 -input3 -intersect -combine6 -input5 -input4 -mlm -export example
#-combine合并數(shù)據(jù) -mlm混合線性模型 -export輸出文件名

一般線性模型

run_pipeline.pl 
-fork1 -h genotype.hmp.txt -filterAlign
-filterAlignMinCount 150 -filterAlignMinFreq 0.05 -filterAlignMaxFreq 1 
-fork2 -r traits.txt 
-fork3 -q population_structure.txt -excludeLastTrait
-combine4 -input1 -input2 -input3 -intersect -glm -export example
#-glm 一般線性模型

4.R語言作圖

Library(qqman)
#加載qqman包

曼哈頓圖

manhattan(example,ylim=c(0,10),col = color_set,annotatePval = 0.01)
# ylim Y軸范圍 col 顏色 annotatePval 標(biāo)記最高位點(diǎn) CHR==1 繪制每個染色體的曼哈頓圖

Q-Q plot

qq(example$P)

七、其他

1.基因組統(tǒng)計(jì)工具

可以統(tǒng)計(jì)fasta和fastq中的信息。

seqkit fx2tab example.fasta -l -n
-l 統(tǒng)計(jì)序列長度 -n 統(tǒng)計(jì)染色體

2.提取文本文檔中某列

用于Tassel關(guān)聯(lián)分析后的結(jié)果文件，提取相應(yīng)的列進(jìn)行R語言繪圖。

cat MLM.txt | awk '{print $1" "$3" "$4" "$7}' > manhattan.txt
# $提取的列數(shù)

3.刪除文本文檔中不包含匹配文本的行

grep -v "LowCoverage" Filt.vcf > Filt1.vcf

參考：

http://www.lxweimin.com/p/0b0c4ab4c38a GATK4全基因組數(shù)據(jù)分析最佳實(shí)踐...

http://starsyi.github.io/2016/05/25/%E5%8F%98%E5%BC%82%E6%A3%80%E6%B5%8B%EF%BC%88BWA-SAMtools-picard-GATK%EF%BC%89/ 變異檢測（BWA+SAMtools+picard+GATK）

http://www.lxweimin.com/p/c41e8f3266b4 GATK4.1 call SNP

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GWAS全基因組關(guān)聯(lián)分析流程（BWA+samtools+gatk+Plink+Admixture+Tassel）

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一、BWA比對

1.構(gòu)建索引

2.進(jìn)行比對

二、samtools格式轉(zhuǎn)換

1.sam格式轉(zhuǎn)換為bam格式

2.質(zhì)控

3.構(gòu)建索引

三、gatk變異檢測

1.排序

2.標(biāo)記重復(fù)序列

注意：

3.檢測變異

合并文件(g.vcf)

檢測變異

4.提取SNP變異

5.對SNP進(jìn)行過濾

6.合并文件(vcf)

四、Plink格式轉(zhuǎn)換及主成分分析

1.VCF格式轉(zhuǎn)換為 ped/map格式

2.ped/map格式轉(zhuǎn)換為bed/bim/fam格式

3.主成分分析

五、Admixture 群體結(jié)構(gòu)

1.群體結(jié)構(gòu)分析

2.R語言作圖

六、Tassel關(guān)聯(lián)分析

1.VCF格式轉(zhuǎn)換為 hmp格式

2.親緣關(guān)系

3.關(guān)聯(lián)分析

混合線性模型

一般線性模型

4.R語言作圖

曼哈頓圖

Q-Q plot

七、其他

1.基因組統(tǒng)計(jì)工具

2.提取文本文檔中某列

3.刪除文本文檔中不包含匹配文本的行

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一、BWA比對

1.構(gòu)建索引

2.進(jìn)行比對

二、samtools格式轉(zhuǎn)換

1.sam格式轉(zhuǎn)換為bam格式

2.質(zhì)控

3.構(gòu)建索引

三、gatk變異檢測

1.排序

2.標(biāo)記重復(fù)序列

注意：

3.檢測變異

合并文件(g.vcf)

檢測變異

4.提取SNP變異

5.對SNP進(jìn)行過濾

6.合并文件(vcf)

四、Plink格式轉(zhuǎn)換及主成分分析

1.VCF格式轉(zhuǎn)換為 ped/map格式

2.ped/map格式轉(zhuǎn)換為bed/bim/fam格式

3.主成分分析

五、Admixture 群體結(jié)構(gòu)

1.群體結(jié)構(gòu)分析

2.R語言作圖

六、Tassel關(guān)聯(lián)分析

1.VCF格式轉(zhuǎn)換為 hmp格式

2.親緣關(guān)系

3.關(guān)聯(lián)分析

混合線性模型

一般線性模型

4.R語言作圖

曼哈頓圖

Q-Q plot

七、其他

1.基因組統(tǒng)計(jì)工具

2.提取文本文檔中某列

3.刪除文本文檔中不包含匹配文本的行

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