文獻

2023?

Nature Plants

Uncovering the transcriptional regulatory network involved in boosting wheat regeneration and transformation

研究背景

1-在擬南芥中，通過側根起始途徑在CIM上激活全能性：生長素誘導WOX11 和 WOX12將具有再生能力的細胞轉為founder cell，然后，WOX5 和 LBD16 將founder cell轉為愈傷組織。

2-除了轉錄因子，許多表觀遺傳修飾已被證實參與了擬南芥再生，如H3K27me3、H3K36me3和H3K4me3都已經被證實影響再生過程，DNA甲基轉移酶MET1也參與了再生過程的調控。

3-與擬南芥相比，小麥的再生更加困難。在小麥中，授粉后約14 天的未成熟胚可作為外植體，且不同基因型小麥的再生效率不同。目前最容易完成再生的小麥品種是Fielder.

本文亮點

1-作者利用RNA-seq、ATAC-seq以及CUT&TAG技術分析了最容易遺傳轉化的六倍體小麥品種“Fielder”未成熟胚再生過程的轉錄水平和染色質狀態。

2-發現在再生過程中，生長素誘導了介導細胞命運轉變的基因的順序表達，并與染色質可及性、H3K27me3和H3K4me3狀態的變化相協調。

3-構建了小麥再生的轉錄調控網絡(TRN)，通過對比小麥和擬南芥的再生過程，發現了DOF轉錄因子在擬南芥和小麥中表達模式不同。實驗驗證表明，TaDOF5.6 和TaDOF3.4 是不同小麥品種轉化效率的潛在促進劑。

結論01?小麥再生過程轉錄和表觀圖譜的描述

Fig 1a

Fig 1b

作者選擇了最容易做成遺傳轉化的小麥品種——Fielder，作為研究材料。取開花后14天收集的未成熟胚的盾片用作再生的外植體，誘導后3d，盾片開始進行細胞分裂并形成愈傷組織，6 d后愈傷組織繼續發育并形成突起。誘導12天后，觀察到莖尖分生組織的形成。作者測定了該過程了15份轉錄組（DAI0-3-6-9-12,每個時間點3份重復），8份ATAC-seq（DAI0-3-6-9,每個時間點2份重復），以及3種組蛋白修飾的24份CUT&TAG數據（Fig1a）。

數據有良好的重復性，并反映了再生進程（Fig 1b）。

Fig 1c

Fig 1d

大部分開放染色質區域和組蛋白修飾位于基因間區（Fig 1c).

開放染色質和H3K27ac的信號主要位于轉錄起始位點(TSS)附近，而H3K27me3和H3K4me3存在于整個基因中(Fig 1d).

Fig 1e

Fig S1d

在再生過程中，共鑒定了40146個差異表達基因(Fig 1e)，展示了轉錄組重編程的程度。

此外，38%的ATAC-seq峰是差異可及的(Fig 1e)，而只有一小部分組蛋白修飾峰顯示差異標記(Fig S1d)。這表明染色質可及性在小麥再生過程中起著至關重要的作用。

Fig 1f-i

為了研究小麥再生過程中的轉錄變化，使用K-均值聚類分析將DEGs分成六個簇(Fig 1f），對每一簇的基因做了轉錄因子富集分析（Fig 1h）和GO富集分析（Fig 1i），以揭示每一簇基因的潛在功能。Fig 1g展示了每一簇的典型再生相關基因表達量。

01 生信分析

主成分分析

差異peak的鑒定及注釋

基因鄰近的metaplot

基因表達的聚類分析

轉錄因子富集分析

GO富集分析

結論2-染色質狀態改變與基因表達相協調

Fig 2a

為了研究小麥再生過程中轉錄譜、染色質可及性和組蛋白修飾之間的關系，作者評估了基因的轉錄水平與各種染色質特征之間的皮爾森相關系數(Fig 2a)。Fig 2a展示了六簇基因的表達量、染色質可及性以及三種組蛋白修飾在再生過程種的變化，每個小圖中右上角的數字代表了相應特征和轉錄水平的皮爾森相關系數。

染色質可及性與所有簇的基因轉錄變化呈正相關，而H3K27me3在大多數簇(C2、C3、C4和C6)中呈負相關。H3K4me3在C1、C3和C4與轉錄正相關。在大多數簇中，H3K27ac與轉錄的相關性較低。

Fig 2b, c

作者定義，如果染色質可及性或組蛋白修飾與轉錄水平的皮爾森相關系數大于0.7或小于-0.7，則認為染色質可及性或組蛋白修飾可以調節基因表達。在再生過程中，97%的差異表達基因在其啟動子或基因區域至少有一個ATAC-seq峰（Fig 2b中ATAC），其中55%受染色質可及性的調節（Fig 2b中ATAC.reg），對于H3K27me3，36%的差異表達基因在啟動子或基因區域至少有一個峰，只有11%受H3K27me3調控。

3299個基因受到染色質可及性及H3K27me3修飾的共同調控（Fig 2b, c）,其中大約一半屬于C3和C4，它們在愈傷組織誘導后期被激活。考慮到C3和C4中的差異表達基因也受H3K4me3調控，作者共確定了1116個受染色質可及性、H3K27me3和H3K4me3調控的差異表達基因。

Fig 2d-e

考慮到C3和C4中的差異表達基因也受H3K4me3調控，作者共確定了1116個受染色質可及性、H3K27me3和H3K4me3調控的差異表達基因。這些基因在生長素信號傳導、根發育、分生組織起始和芽系統發育等過程中發揮重要作用(Fig 2d)，Fig 2e展示了已知與再生過程相關的幾個基因的轉錄水平、染色質可及性以及組蛋白修飾。以上分析強調了再再生過程中，染色質可及性和組蛋白修飾可以協同調控基因表達。

02 生信分析

相關性的計算

旭日圖

GO富集

結論3-生長素促進愈傷組織誘導并與細胞分裂素相互作用

Fig 3a

生長素是植物再生過程的關鍵激素。在具有再生潛能的細胞中，生長素可以直接激活WOX11的表達，將具有再生潛能的細胞轉變為根創始細胞。然后，WOX11可以激活WOX5等基因的表達，促使根創始細胞分裂形成根原基。所以，根據WOX11和WOX5的表達，作者將再生過程分成了根創始細胞的形成（DAI3）和根原基的形成(DAI6、9、12)兩個階段(Fig 3a)。

根創始細胞的形成需要大量的局部生長素，這可能是由生長素運輸基因（如TaABCB1、TaABCB3和TaLAX1）的表達所促進的。生長素信號對刺激根原基的形成和維持也至關重要，作者觀察到的生長素信號通路相關基因（如TaTIR1、TaIAA3和TaARF5）的激活支持了這一點。

Fig 3b, c

生長素信號通路的轉錄調控依賴于生長素響應因子（ARF），ARF能夠與生長素響應基因的順式作用元件(AuxRE)結合進而調控相關基因表達。接下來，作者想知道生長素信號，特別是ARF，是如何參與小麥再生的。

確定ARF靶基因的兩個指標：1、基因啟動子或基因區域的ATAC-seq peak包含ARF結合基序（AuxRE）；2、施加生長素后表達上調（位于C2-C6中的任何一組）。

共鑒定出9471個與生長素信號通路、細胞周期和芽部發育相關的靶基因（Fig 3b），可以分成三組：第一組包括已知參與植物再生的基因，如分生組織識別基因TaWOX5、TaBBM、TaSCR和細胞周期相關基因，表明生長素信號在驅動愈傷組織誘導過程中的作用；第二組基因與細胞分裂素相關，包括TaIPT2、TaAHK3和TaARR10等，這表明生長素信號可以激活細胞分裂素途徑，從而啟動隨后的器官分化；第三組基因包括生長素合成基因TaYUC3、轉運基因TaPIN1和生長素F-BOX蛋白5 (TaAFB5)信號通路基因。

因此，在小麥再生的不同階段，ARFs可能在維持生長素濃度和信號傳導平衡中發揮作用。

Fig 3d, e

ARF的靶基因中包含許多與細胞分裂素相關的基因，細胞分裂素信號轉導途徑包含多種蛋白質，包括B型ARR，已經被證實參與調控擬南芥離體苗再生。通過ChromVar評估，B型ARR結合基序的活性在DAI 6時顯著升高（Fig 3d），用類似前面提到的方法鑒定了2924個B型ARR的潛在靶基因，這些基因包括參與根發育的TaWOX5和TaLBD13。

并且，一些參與生長素運輸和信號傳導的基因，如TaPIN1和TaARF10，同時受到B-ARR和ARF的調節(圖3e)，表明生長素和細胞分裂素信號傳導之間存在串擾。

03 生信分析

轉錄因子靶基因的鑒定

motif活性

結論4-構建轉錄調控網絡TRN

Fig 4a

為了構建轉錄因子和靶基因的對應關系，作者利用ATAC-seq數據進行了足跡（footprints）分析。所謂ATAC-seq足跡，即轉錄因子與DNA結合，從而阻止Tn5在結合位點切割，所以形成了一個被保護的區域，反映在比對上，會形成一個低覆蓋度的區域。

參與植物再生的已知調節因子，如LEC2、DOF5.6、WOX11和BBM，其轉錄因子足跡的染色質可及性在再生過程中發生了顯著變化(Fig 4a)，表明它們具有潛在的功能重要性。

Fig S4a

Fig 4b

基于以下三個標準構建了該轉錄調控網絡：1、TF與靶基因存在調控關系；2、TF與靶基因共表達；3、只考慮六個cluster中可以顯著富集到的轉錄因子（Fig S4a和Fig 4b）。其中1是根據ATAC-seq鑒定到的足跡，利用擬南芥中已知的TF調控motif來初步確定TF與靶基因的調控，2是根據表達對1根據序列得到的結果進一步篩選，3是為了構建再生過程的核心調控關系。

最終，得到一個包含31,272個節點和8,856,326條邊的網絡，其中有1,766個轉錄因子。

04 生信分析

ATAC-seq足跡鑒定

轉錄因子靶基因鑒定

轉錄因子富集分析

結論5-利用轉錄調控網絡TRN發掘核心轉錄因子

Fig 4c, d

Fig S4h

為了確定基因表達的時間順序，我們進行了偽時間分析。不同簇的時間序列表達模式清晰，順序為C1-C5-C6-C2-C3-C4(Fig 4c), 然后生成一個集群內的監管網絡，以探索不同集群之間的監管關系(Fig 4d)。

在DAI 0特異性高表達的C1與其他簇之間沒有調節關系，進一步強調了生長素處理的作用。C5-C6-C2-C3-C4集群之間的調控關系遵循基因表達的時間軸，作者推測兩種不同的調控模式共存驅動小麥再生（Fig S4h）：第一類指每個簇中的基因受同一簇中的TF調控，第二類指后表達簇中的基因受前表達簇中的TF調控。

Fig 4f

Fig 4g, h

結合這兩種調控模式，作者確定了446個核心轉錄因子，它們要么富集于其自身集群的靶基因上游（I型調控模式），要么在下一簇靶基因上游富集（II型調控模式）。

其中AP2、ERF、HD-ZIP、DOF、G2-like和NAC家族富集(Fig 4f)， 40個轉錄因子是在擬南芥中功能性測試的再生因子的同源物(Fig 4g) ，并且這些基因在小麥再生過程中表現出順序調控(Fig 4h)，如TaWOX11、TaDOF5.6和TaWIND3先被激活，然后再激活TaBBM、TaAIL5和TaSCR來促進愈傷組織的形成。

Fig S6a

Fig S6b

Fig S6c, d

進一步，作者使用來自12個小麥品種的已發表表型和基因型數據來評估位于446個核心TF的啟動子和基因區域的DNA變異對再生效率的影響。三個基因的DNA變異與愈傷組織分化率呈顯著相關，其中，WOX基因開放染色質區域內的單核苷酸多態性與12個品種間愈傷組織分化差異顯著相關(Fig S6c,d)。

這些結果表明，來自TRN核心TFs的因素可能導致小麥品種間再生效率的差異。

05 生信分析

偽時間分析

轉錄因子富集分析

結論6-小麥和擬南芥誘導愈傷過程的比較

Fig 5a, b

由于驅動再生的核心TRN在小麥和擬南芥中含有保守的TFs，我們比較了這兩個物種的過程，特別是愈傷組織誘導。對每個物種的不同階段進行了差異表達分析，并從DEG中鑒定了同源基因。根據有無同源基因以及差異表達情況，可以分成三組（Fig 5a）：group1即物種特異性的DEG，group2即在某一物種中是DEG但是在另一物種中不表達或者不差異表達的基因，group3即在某物種中差異表達并且在另一個物種的同源基因也差異表達。

為了進行比較，重點研究了group3，利用物種內Z-score標準化基因表達和染色質可及性譜，然后進行了聚類（Fig 5b），盡管使用的外植體不同，小麥為未成熟胚，擬南芥為下胚軸，但愈傷組織誘導過程是保守的，這一點可以從兩個物種之間同一誘導階段的樣品比同一物種內不同誘導階段的樣品更相似的事實中得到證明（Fig 5b）。

Fig 5c

許多已知參與再生的基因，如BBM、SHR、REV、AIL5和激素相關基因AHK4、PIN1、ARF5和ARR12，在小麥和擬南芥的愈傷組織形成過程中表現出相似的表達模式(Fig5c)。

然而，一些再生因子在兩個物種中表現出不同的表達模式，如LBD17和ANAC011(Fig5c)。因此，雖然同源基因參與了小麥和擬南芥的早期再生過程，但可能存在物種特異性表達模式和轉錄調控途徑。

Fig 5d

Fig 5e

根據表達模式的相關性，將同源基因分為兩類:表達模式相似或不同的同源基因。基因。達模式的相似性或差異與同源物近端區域的染色質可及性密切相關（Fig5d）。為了深入了解這兩類基因，作者在c1-c6的同源基因中進行了over-representation analysis （Fig5e），具有相似表達模式的同源基因主要富集在C1和C6中。

Fig 5f, g

具有不同表達模式的同源基因在愈傷組織誘導早期被生長素短暫誘導的C5中被發現豐富，C5主要富集DOF 和 G2-like家族 (Fig 5f)，例如，DOF5.6在小麥愈傷組織誘導早期表達水平上調，而在擬南芥愈傷組織誘導后期表達水平上調 (Fig 5g)

Fig S7d

Fig S7g

為了擬南芥和小麥更好的對比，作者也對擬南芥的轉錄組做了K均聚類（Fig S7d），并確定了擬南芥中的A3簇和小麥的C5簇表達類似。然而，與DOF家族在小麥C5中富集不同，LBD和NAC家族在擬南芥簇A3中富集(Fig S7g).

小麥和擬南芥在愈傷組織誘導早期所觀察到的差異可能是由于所使用外植體的種特異性造成的。之前的研究發現，LBD和NAC在擬南芥再生中發揮重要作用，所以DOF和G2-like對小麥再生的影響值得進一步研究。

06 生信分析

基因的聚類分析

基因功能富集分析

結論7-轉錄因子DOF提高了小麥的再生效率

Fig 6a

Fig 6b, c

文章的最后一部分，作者探究了DOF轉錄因子對再生的影響。小麥中， 生長素處理后TaDOF5.6和TaDOF3.4的表達水平上調最為顯著(DAI 3)，同時H3K27me3被去除 （Fig6a），并且TaDOF5.6和TaDOF3.4屬于前面鑒定到的446個核心轉錄因子，因此選擇這兩個基因用于后續驗證。

對小麥品種Fielder的未成熟胚胎進行的TaDOF5.6和TaDOF3.4 的共轉(Fig 6b)，發現與GUS陰性對照相比，愈傷組織誘導效率和轉化效率均有顯著提高。

Fig 6d, e

與GUS相比，轉化TaDOF5.6和TaDOF3.4的愈傷組織誘導效率分別從52%提高到88%和85%(Fig 6d)，在相同處理下，轉化效率分別從26%提高到50%和55% (Fig 6e).

把小麥品種擴展到JM22 和 KN199，也能發現明顯的再生能力提升（Fig6d, e），上述結果表明，TaDOF5.6和TaDOF3.4可以提高不同小麥品種的轉化效率。

Fig 6f

Fig 6g

Fig 6h

有研究發現DOF3.4可以通過激活細胞增殖基因參與再生。在我們的TRN中，TaDOF5.6和TaDOF3.4可以直接調節與根和莖分生組織形成相關的基因，如LBDs、YABs和SCL2的表達提高小麥的再生效率。

原位雜交證實，TaDOF5.6僅在DAI 3的原形成層區表達，而TaDOF3.4在DAI 3的表皮下三到四層、DAI 6的愈傷組織和DAI 9的芽原基的中表達(Fig 6f)。

隨后，從轉化的TaDOF5.6、TaDOF3.4和GUS對照中收集材料，我們發現與GUS相比，TaLBD4和TaSCL27在TaDOF3.4或TaDOF5.6轉化的組織中表達水平更高(Fig 6g), 轉錄報告基因實驗進一步驗證了TaDOF3.4對TaLBD4和TaSCL27的調控作用(Fig 6h)。

綜上，TaDOF5.6和TaDOF3.4可以作為小麥轉化的新型促進劑來提高轉化效率。

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