作者：堯小飛
審稿：童蒙
編輯：amethyst
01 背景介紹
目前在NGS的科技服務市場上單細胞轉錄組和三代是最火的兩個方向，也是由于工業技術升級帶來的研究的新方向和新視野（單細胞分篩技術和單分子全長測序）。單細胞技術為我們研究細胞的異質性、細胞發育、腫瘤微環境、精準醫療帶來了巨大的進步，大大促進了研究從混合細胞到單細胞的水平的進步，進一步揭示了生物體的微觀視野的變化規律。單分子全長能夠在不打斷的前提下直接測mRNA或者DNA全長序列，避免了短序列的拼接可能出現的錯誤，發現了大量之前未發現的新的轉錄本。
那么有沒有辦法能夠將兩者的技術結合起來，在單細胞層面研究其全長轉錄本的變化規律？答案是肯定的，早在2018年10月的時候Ishaan等人就在Nature Biotechnology（https://www.nature.com/nbt）上發表了單細胞全長轉錄組的研究方法，作者主要是利用10xGenomics公司的單細胞分篩平臺，得到單個細胞的全長cDNA文庫，然后用Pacbio平臺的建庫技術進行三代建庫，然后測得單個細胞全長轉錄本，通過研究不同亞群細胞的轉錄本特征，發現了亞群特異的轉錄本，這從另外一個視野研究了細胞的異質性。
雖然上面解決了沒有單細胞全長轉錄本的問題，但是Ishaan等人的方法將會具有一個巨大的成本問題，三代和單細胞轉錄組本來成本就有些較高，兩者結合起來，如果還要用三代定量的話，一個樣品初步預計也得快20萬了，因此此方案不太適合推廣。雖然目前三代供應商Pacbio和ONT都有單細胞轉錄組解決方法，但都有面對成本的問題，因此亟需一個低成本的單細胞全長轉錄本或者類似的方案。
Rickard團隊是單細胞領域中鼎鼎大名的團隊，在10xGenomics平臺問世之前，他們團隊開發的smart-seq是單細胞轉錄組領域中絕對的王者。時隔7年，2020年5月6日，Rickard團隊在smart-seq2的基礎上，通過改進開發了smart-seq3技術（Single-cell RNA counting at allele and isoform resolution using Smart-seq3）（https://www.nature.com/articles/s41587-020-0497-0），該技術就是低成本的單細胞全長轉錄組的解決方案，并將該技術發表在Nature Biotechnology 。
02 Smart-seq3建庫基本原理
Smart-seq3既然號稱能夠在轉錄本水平研究單細胞的異質性，那么它究竟是如何達到的呢？我們首先看看其建庫原理。原理圖如下：
從上面的建庫原理圖來看，其建庫方式基本上與smart-seq2一致，最大的不同在于在Tn5酶的tag后面添加了UMI序列（上圖中的紅色x號表示轉錄本的突變位點），其建庫流程如下：
- 通過oligo-dT priming釣取含有polyA尾巴的mRNA。
- 通過TSO(template-switching oligo)進行反轉錄，合成全長cDNA文庫，得到A1序列。TOS序列構成：Tn5 motif 11 and a novel 11-bp tag sequence, followed by an 8-bp UMI sequence and three riboguanosines.
- 通過PCR擴增，將A1序列進行擴增，擴增多條序列。
- tagmentation，通過Tn5-based進行tagmentation，然后構建測序上機文庫。
- 通過UMI序列區分是否是internal reads，挑選5‘帶有UMI序列，構建延伸轉錄本。
在構建轉錄組的過程中，主要是挑選5’UMI序列的雙端序列進行構建；由于5‘都是一樣的，但是3’不一樣（綠色的條塊），因此可以將具有相同的5‘端的序列，不同3’的序列進行合并，延伸轉錄本，得到更長的轉錄本。這種方式得到的轉錄本當然沒有Pacbio等三大方法得到的全長轉錄本長、全，但是相對于普通單細胞轉錄組來說，轉錄本長度大大增加了，提供了單細胞水平的轉錄組的特征。下圖為Smart-seq3文庫長度分布（其文庫長度分布在600-2000bp之間）：
03 Smart-seq3與 PacBio 結果比較
既然smart-seq3是為了達到轉錄組水平開發的技術，那就需要比較一下它與真正的三代技術具體有什么差異，到底有什么區別？作者構建了369 individual primary mouse fibroblasts ( F1 offspring from CAST/EiJ and C57/Bl6J strains ) 文庫，然后構建全長轉錄本，并且同時使用smart-seq3構建的cDNA文庫進行Pacbio建庫，建庫用的是SMRTbell Template Prep Kit 1.0-SPv3試劑盒，可以構建500–2,000 bp的文庫， Circular consensus sequencing (CCS) reads were generated from raw reads using the SMRTlink pipeline。
注：Summarizing the numbers of RNA molecules (x axis, log 10 ) reconstructed to different lengths (in base pairs, y axis), showing only molecules additionally assigned to a unique transcript isoform. In total, the 1 million longest reconstructed RNA molecules are shown from one experiment with 369 mouse fibroblasts, with molecules shown in descending order.
上表格展示了Smart-seq3的轉錄本長度和數目分布的數據，從上圖可以看出，smart-seq3可以構建較長的轉錄本，可以從轉錄組水平上研究單細胞的異質性。與PacBio的數據相比， 有54,302 RNA分子在smart-seq3和Pacbio兩種平臺都能檢出；smart-seq3檢出的全長轉錄本數目占Pacbio的 46% 。如下圖a所示。
具體就 Col1a2基因來說，該轉錄本長度為2.3kb， Smart-seq3構建轉錄本長度為1.9 kb，Pacbio的轉錄本長度為2.267kb。
04 Smart-seq3其他方面的優勢
今天在這里主要介紹了Smart-seq3構建全長轉錄本的特點，沒有對其他的優點進行詳細介紹，如果對此感興趣，可以翻一翻原文。其實Smart-seq3在Smart-seq2的基礎上有較大的技術改進和提示，比如另外一個比較重要的方面就是SNP分型的問題，比如做測試的 CAST and C57 alleles，Smart-seq3的結果較Smart-seq2的結果相關性有顯著性的提高，由之前的 0.79和0.68提升到了0.94和0.75。
另外Smart-seq3的基因檢出較Smart-seq2有顯著性的提高，而且編碼蛋白、lncRNA檢出也有較高的提高。
05 總結
總而言之，Smart-seq3與Smart-seq2相比較，無論是在基因分型、轉錄本長度、編碼基因和lncRNA基因的檢出數來說，都具有了較大的提升。特別是Smart-seq3可以構建全長轉錄本，讓研究者可以研究單細胞水平上的轉錄本特性，雖然轉錄本檢出只有Pacbio的46%，但是其優點在于可以在較低的成本情況下，研究單細胞水平的轉錄本特征。
目前單細胞水平的全長轉錄本解決方案較多，比如Pacbio和ONT都推出了相應的解決方案，但是三代+單細胞的方案難以企及的成本，影響了其推廣應用；Smart-seq3在一定程度上的解決了此問題，可以在目前進行推廣應用；當然如果用Smart-seq3+三代的話，其構建的轉錄本將會更完整。
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