首先解釋一下，為什么要分析灰度值？

灰度的概念是使用黑色調表示物體，即用黑色為基準色，不同的飽和度的黑色來顯示圖像。采用ECL發光時，蛋白條帶發出的熒光會曝光在膠片上，留下的黑色條帶。然而膠片掃描后為藍色背景、黑色條帶，這并不是單純的黑灰白顏色。因此，我們首先得在Photoshop中將整張圖片去色，使彩色圖片變成黑白圖片，形成近灰色背景、黑色條帶的圖片類型。此時，條帶的深淺和面積綜合代表著蛋白的量?；叶戎捣治鲎匀痪统蔀槲覀兊氖走x。

延伸說一下，免疫組織化學染色(IHC)結果本身為近白色背景、棕黃色陽性表達，這時我們就不能直接用灰度反映陽性表達強弱了，而是積分吸光度，也就是咱們常說的平均光密度(IOD)。如果你真的想用灰度計算IHC結果，顯然你需要將圖片轉為灰度圖再計算。此處不表。

分析圖文步驟如下：

Image J軟件界面 ↓

1. 圖片轉換為黑白圖：

首先使用Photoshop打開膠片掃描圖片，點擊“圖像>調整>去色”，將彩色圖片轉化為黑白圖片，并使用裁剪工具將目標條帶裁剪至合適大小后另存圖片。

2.打開Image J軟件：

2.1.打開圖片文件：File>Open；將圖片轉化為8bit類型：Image>Type>8-bit。

(此步驟的目的是為了將圖片的每個像素用8bit表示，這樣的話，整個圖片的灰度將分為256個級別，即黑、灰、白的像素模式；若保留原始的16bit格式或RGB格式，圖片灰度級別會呈指數增長，并有其它顏色混入，造成計算誤差。)

2.2.將整張圖片背景灰度均一化，消除圖片背景影響：

Process>Subtract Background，默認數值為50即可。

2.3將圖片黑白顏色反轉。

使背景為黑色而條帶為白色。既還原了條帶發光時的樣子，也方便我們后面圈選條帶：Edit>Invert。

2.4設置從測量指標：

Analyze>Set Measurements，選擇Area面積、平均灰度值Mean gray value、積分灰度值Integrated dendity。

(解釋一下，我們最終要使用的值為積分灰度Integrated dendity，而不是平均密度值Mean gray value。因為平均灰度僅是選定區域的平均灰度數值，而積分密度值則加權了平均灰度和選定的面積，這樣選擇就消除了選定面積大小對灰度值的影響。希望大家能好好理解這一概念，未來小編講到IHC測量時將詳細說明。)

2.5設置測量單位為“單個像素”：

Analyze>Set Scale，將Unit of length中的inch改為pixels。

2.6選定需要測量的條帶，并測量積分光密度：

使用矩形選框、橢圓形選框或手動繪制選框(手殘黨勿用)，將面積最大的條帶完全圈住，快捷鍵Ctrl+m測量，彈出Results結果框，結果中的IntDen即積分灰度值；繼續左鍵點擊選定框中間，不要點框線(否則選定框的大小會改變，要保證框選范圍一致)，拖動選定框并移動至其它條帶，快捷鍵Ctrl+m測量；重復操作至所有條帶測完，最后不要忘了在圖片無條帶位置加測背景的灰度。

2.7測量結束后，點擊Results框中的Edit，選擇Select All，粘貼至Excel，開始下一步的分析。

2.8積分灰度值的計算和標準化

首先，將所有條帶的IntDen都減去圖片背景的IntDen，以扣除背景影響；然后用目標蛋白的灰度值除以其對應泳道的內參照條帶灰度值，以此作為該組的目標蛋白相對表達量A。

標準化方法1：如果你是用一張膜來統計，那么直接用所有組的A值除以對照組A值，此時對照組結果為1，其它組結果為對照組的倍數，以此做均一化。

標準化方法2：如果你是用2張或以上的膜來一起統計，那么首先計算所有膜上的對照組A的平均值A’，然后用其它組的A值除以A’，以此做均一化。這種方法的前提是不同膜之間的背景顏色要相近，若偏差大則數據會很亂。

事實上，還有一種采用波峰下面積分析條帶的方法。即通過半自動描繪電泳條帶的等高線邊緣來得到等高線區域內部面積，再將該面積乘以區域內平均光密度值得到條帶內部總的信號量。這種計算方法可在Image J或者Quantity One上實現。但是有人注意到此法的缺陷，故小編沒有具體說明這種測量方法。附上鏈接，有興趣的同志們可以看看。

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