在過(guò)去的十年中，環(huán)狀RNA (circRNAs)作為一大類主要是非編碼RNA分子出現(xiàn)，通過(guò)不同的作用機(jī)制在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此前，《Nature Reviews Clinical Oncology》發(fā)表了題為“The emerging roles of circRNAs ?in cancer and oncology”的綜述文章，回顧了目前關(guān)于circRNA在癌癥中的生物發(fā)生、調(diào)節(jié)和功能的知識(shí)，以及它們作為生物標(biāo)記物、治療劑和藥物靶點(diǎn)的臨床潛力。
circRNA的生物發(fā)生、轉(zhuǎn)運(yùn)、降解
circRNA的生物生成依賴于典型的剪接體機(jī)制，但其效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常規(guī)的線性剪接。然而，一旦circRNAs形成，它們就特別穩(wěn)定，并能在細(xì)胞質(zhì)中積累。
circRNA的生物發(fā)生
典型RNA剪接通過(guò)內(nèi)含子將上游5′剪接位點(diǎn)（剪接供體）連接到下游3′剪接位點(diǎn)（剪接受體），導(dǎo)致相鄰?fù)怙@子之間的內(nèi)含子被移除。然而，許多前mRNA可以進(jìn)行反剪接，即下游剪接供體與上游剪接受體相連接，跨越一個(gè)或多個(gè)外顯子，產(chǎn)生一個(gè)共價(jià)封閉的circRNA。對(duì)于許多基因來(lái)說(shuō)，前mRNA的線性剪接和反剪接之間會(huì)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，有幾個(gè)因素會(huì)影響這兩種剪接方式的平衡。在癌癥中，這種平衡經(jīng)常被破壞，導(dǎo)致circRNA的表達(dá)失調(diào)。
反向剪接需要在下游剪接供體和上游剪接受體位點(diǎn)兩側(cè)的內(nèi)含子上繞圈，使這些剪接位點(diǎn)接近，并產(chǎn)生外顯子circRNAs（EcircRNAs）；或者，如果內(nèi)含子保留在環(huán)中，則產(chǎn)生外顯子-內(nèi)含子環(huán)狀RNA（EIciRNAs）。反向內(nèi)含子重復(fù)序列（如Alu元件）、非重復(fù)互補(bǔ)序列或RNA結(jié)合蛋白（RBPs）的二聚化可促進(jìn)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的形成。
一種新型的circRNAs，即readthrough?circRNAs，是通過(guò)轉(zhuǎn)錄終止的失敗而產(chǎn)生的，轉(zhuǎn)錄本由此延伸到下游基因并隨后反向擴(kuò)增。因此，circRNA可以包含來(lái)自相鄰基因的外顯子。轉(zhuǎn)錄終止的整體效率已被證明在癌癥中發(fā)生了改變，這增加了readthrough circRNAs影響疾病表型的可能性。
由于易位連接上游和下游內(nèi)含子中互補(bǔ)序列的并置，染色體易位可導(dǎo)致融合circRNAs（f-circRNAs），這可能獨(dú)立于其融合蛋白對(duì)應(yīng)物而促進(jìn)癌癥的發(fā)展。與致癌融合蛋白結(jié)合，f-circRNA甚至可以促進(jìn)體內(nèi)白血病的進(jìn)展。
此外，circRNA可以通過(guò)其宿主基因啟動(dòng)子的超甲基化或改變組蛋白修飾而經(jīng)歷癌癥特異性轉(zhuǎn)錄沉默。
circRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)
EcircRNAs主要定位于細(xì)胞質(zhì)，而EIciRNAs和ciRNAs通常保留在細(xì)胞核中。circRNAs如何從細(xì)胞核中輸出尚不完全清楚，但ATP依賴的RNA螺旋酶DDX39A和剪接體RNA螺旋酶DDX39B已被證明參與這一過(guò)程，其方式取決于circRNA的長(zhǎng)度。此外，N6-甲基腺苷（m6A）修飾經(jīng)常出現(xiàn)在circRNA中，并被證明會(huì)影響其出核。
circRNA的降解
circRNA對(duì)線性RNA降解機(jī)制有抵抗力，circRNA降解的機(jī)制尚待完全闡明。例如ciRS-7（也稱為CDR1as），可以通過(guò)依賴于特定miRNA的高度互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)miR-671的方式降解，該位點(diǎn)可以觸發(fā)Argonaute 2（AGO2）對(duì)產(chǎn)生的雙鏈RNA雙鏈體的切割，Argonaute 2是RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物的關(guān)鍵成分。在一個(gè)更全面的層面上，核內(nèi)核糖核酸酶與circRNA降解有關(guān)。此外，高度結(jié)構(gòu)化的circRNAA可能會(huì)受到ATP依賴性解旋酶UPF1和G3BP1介導(dǎo)的降解，其降解方式可能取決于G3BP1固有的內(nèi)切核酸酶活性。
circRNA的作用機(jī)制
circRNA發(fā)揮其功能從而影響癌癥發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制多種多樣。circRNA的序列和穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄后修飾、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及它們的積累方式和定位決定了它們的功能。
MicroRNA sponging。位于細(xì)胞質(zhì)中的circRNAs可以通過(guò)對(duì)miRNAs的海綿化作用參與轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控，從而阻止特定的miRNAs與靶mRNAs相互作用并抑制它們。最好的miRNA海綿候選者ciRS-7含有超過(guò)60個(gè)miR-7結(jié)合位點(diǎn)，可能在某些組織中作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA（ceRNA）發(fā)揮作用。然而，ciRS-7在癌細(xì)胞中作為ceRNA發(fā)揮作用的觀點(diǎn)受到了挑戰(zhàn)，在推斷circRNA的miRNA海綿特性時(shí)，應(yīng)考慮該領(lǐng)域的一些爭(zhēng)議。CircHIPK3是另一個(gè)具有潛在海棉特性的circRNA的例子，它可能結(jié)合幾種不同的miRNA，包括抑制腫瘤的miR-124，沉默這種circRNA可以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。
蛋白質(zhì)相互作用。一些circRNAs可以與RBP相互作用，起到蛋白質(zhì)海綿或抑制劑的作用，可以作為支架使不同的蛋白質(zhì)接近，或者可以將蛋白質(zhì)招募到特定的亞細(xì)胞隔室。例如一種在HeLa細(xì)胞中具有蛋白質(zhì)海綿特性的circRNA，即circPABPN1，它與線性PABPN1mRNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ELAV1（也稱為HuR），從而抑制PABPN1翻譯。
circRNA的翻譯。檢測(cè)circRNA衍生肽或蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)存在許多缺陷，因此應(yīng)仔細(xì)設(shè)計(jì)。作為一個(gè)類別，circRNAs通常被認(rèn)為是非編碼的；然而，包括circ-ZNF609和circMbl在內(nèi)的特定circRNA含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES），可以進(jìn)行不依賴于cap的翻譯，而包括circARHGAP35在內(nèi)的其他circRNA可以進(jìn)行m6A依賴翻譯。一些circRNA，包括一個(gè)來(lái)源于E-鈣粘蛋白基因（CDH1）的circRNA（命名為circ-E-Cad），編碼在癌癥中具有潛在功能相關(guān)性的獨(dú)特肽，本綜述稍后將進(jìn)一步討論。circRNA還可以編碼與癌癥功能相關(guān)的較大蛋白質(zhì)（如circARHGAP35和circMAPK1產(chǎn)生的致癌蛋白質(zhì)）。此外，來(lái)源于病毒的circRNA可以被翻譯，如來(lái)源于人乳頭瘤病毒的circE7，其在宮頸癌和頭頸癌中大量表達(dá)并具有致癌活性。
circRNA的生理作用
circRNA主要是在疾病背景下研究的，但越來(lái)越多的證據(jù)也表明在正常生理?xiàng)l件下具有重要功能。在這里，我們關(guān)注與癌癥相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)過(guò)程。有趣的是，多項(xiàng)研究指出了特定circRNA在維持胚胎和成人干細(xì)胞的干細(xì)胞和多能干細(xì)胞中的關(guān)鍵作用，而其他研究表明circRNA是干細(xì)胞分化和組織發(fā)育、維持和恢復(fù)的重要決定因素。
circRNA在癌癥中的病理生理功能
在致癌轉(zhuǎn)化過(guò)程中，經(jīng)常觀察到從頭獲得的干細(xì)胞和發(fā)育基因表達(dá)程序，由此產(chǎn)生的細(xì)胞具有無(wú)限的自我更新潛力。因此circRNA包括上面描述的那些作用，有望在解除管制時(shí)在癌癥發(fā)展中發(fā)揮作用。例如，circ-ZNF609已在癌癥中被廣泛研究，并顯示通過(guò)增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的干性促進(jìn)肝癌的發(fā)生。在機(jī)制上，circ-ZNF609通過(guò)分泌miR-15a-5p和miR-15b-5p激活HCC細(xì)胞中的Hedgehog信號(hào)，其參與Hedgehog信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄因子GLI2的轉(zhuǎn)錄后沉默。CircZKSCAN1和circEPHB4是另外兩個(gè)分別調(diào)節(jié)肝癌和膠質(zhì)瘤中腫瘤干細(xì)胞特性的circRNA的例子。此外，來(lái)源于E-鈣粘蛋白前體mRNA的circ-E-Cad編碼肽C-E-Cad，與EGFR相互作用并激活下游STAT3信號(hào)，從而促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、存活和侵襲，從而有助于維持膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的癌干細(xì)胞狀態(tài)。源自致癌病毒的circRNAs也可能誘發(fā)癌癥干細(xì)胞的特性，如胃癌中Epstein-Barr病毒衍生的circLMP2A就是一個(gè)例子。
除了癌細(xì)胞干性之外，在所有常見的癌癥類型和許多罕見的惡性腫瘤中都觀察到廣泛的circRNA表達(dá)失調(diào)，在快速增殖的癌細(xì)胞中circRNA水平通常降低。
調(diào)控細(xì)胞周期的circRNA。已發(fā)現(xiàn)許多單獨(dú)的環(huán)狀RNA促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展。研究者們發(fā)現(xiàn)許多circRNA是細(xì)胞增殖所必需的，包括circHIPK3和circKLHL，對(duì)于這些circRNAs，用短發(fā)夾RNA介導(dǎo)的敲除法也觀察到了類似的表型。對(duì)circFAM120A進(jìn)一步的機(jī)制分析，發(fā)現(xiàn)這種circRNA通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地與IGF2BP2（一種翻譯抑制劑）結(jié)合，促進(jìn)了來(lái)自其宿主基因FAM120A（一種參與AKT信號(hào)通路的腫瘤基因）的mRNA的有效翻譯，盡管circRNA的含量比mRNA少。這一發(fā)現(xiàn)意味著IGF2BP2優(yōu)先與circRNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合，而circFAM120A的m6A修飾被證明是其增強(qiáng)IGF2BP2結(jié)合能力的原因。與FAM120A一樣，MAPK1是一個(gè)直接參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的致癌基因，導(dǎo)致細(xì)胞增殖。在肺鱗癌中，源自TP63基因的circRNA的上調(diào)，circTP63也能促進(jìn)細(xì)胞增殖。Circ-ZNF609還通過(guò)調(diào)節(jié)G1/S轉(zhuǎn)換直接參與細(xì)胞周期。CircPVT1來(lái)自非編碼的PVT1基因座，是另一個(gè)在癌癥中被廣泛研究的circRNA，大多數(shù)研究表明其致癌活性是通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞周期的進(jìn)展。
circRNA與細(xì)胞凋亡或自噬。盡管獲得了大量的遺傳和表觀遺傳畸變，避免細(xì)胞凋亡是癌細(xì)胞繼續(xù)增殖的關(guān)鍵--因此也是腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)鍵。許多單獨(dú)的circRNAs已經(jīng)被證明可以通過(guò)抑制或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮作用。后者的一個(gè)例子是circ-Foxo3，它與MDM2結(jié)合并阻止其與FOXO3相互作用，從而抑制其宿主基因的蛋白體產(chǎn)物的泛素介導(dǎo)的蛋白體降解。自噬是另一個(gè)在癌癥中起重要作用的過(guò)程，已證明可促進(jìn)自噬的circRNA實(shí)例包括卵巢癌和乳腺癌中的circRAB11FIP1和circr-DNMT1。
參與血管生成的circRNA。血管生成是癌細(xì)胞進(jìn)入血管系統(tǒng)并隨后轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。在膀胱癌中，circHIPK3的下調(diào)與侵襲性腫瘤表型和不利的臨床結(jié)果有關(guān)，可能反映了這種circRNA在血管生成和轉(zhuǎn)移中的抑制作用。circHIPK3已被證明能海綿化miR-558，鑒于它與啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合并上調(diào)HPSE的轉(zhuǎn)錄，其具有miRNA的非經(jīng)典功能。HPSE編碼肝素酶，這是一種內(nèi)切糖苷酶，可裂解細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)硫酸肝素蛋白多糖，導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）的釋放，兩者都是重要的促血管生成因素。circSMARCA5是抑制血管生成的circRNA的另一個(gè)例子。相反，circRNA可以誘導(dǎo)血管生成，例如circ-CCAC1在膽管癌中的應(yīng)用和circPOK在肉瘤中的應(yīng)用。
circRNA與無(wú)限增殖。保護(hù)染色體末端的端粒對(duì)于癌細(xì)胞無(wú)限增殖的能力至關(guān)重要，一些circRNA被認(rèn)為可以影響端粒酶的活性，包括circMEG3和circWHSC1。
circRNA與細(xì)胞能量。癌細(xì)胞需要重新規(guī)劃它們的能量代謝，以便在氧氣和葡萄糖供應(yīng)的波動(dòng)條件下不斷為細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂提供能量。α-烯醇化酶由ENO1編碼，是一種重要的糖酵解酶，有助于癌癥的進(jìn)展。有趣的是，該基因還產(chǎn)生一種circRNA：circ-ENO1，已被證明通過(guò)分泌miR-22-3p促進(jìn)糖酵解和肺腺癌的進(jìn)展，導(dǎo)致其線性mRNA對(duì)應(yīng)物的上調(diào)。而circATP2B1則是促進(jìn)糖酵解的另一個(gè)例子。
circRNA和腫瘤免疫監(jiān)測(cè)。免疫系統(tǒng)協(xié)調(diào)各種保護(hù)性反應(yīng)以對(duì)抗腫瘤的發(fā)展，內(nèi)源性circRNA通過(guò)結(jié)合和抑制蛋白激酶R（PKR）參與抑制先天性免疫反應(yīng)。核酸傳感器RIG-I也可以檢測(cè)到外源（但不是內(nèi)源性）circRNA，它誘導(dǎo)I型和III型干擾素應(yīng)答。circNDUFB2通過(guò)破壞其解旋酶和CARD結(jié)構(gòu)域之間的分子內(nèi)相互作用來(lái)激活RIG-I，從而增強(qiáng)了RIG-I和線粒體抗病毒信號(hào)蛋白（MAVS）之間的相互作用，從而增強(qiáng)了NSCLC細(xì)胞的免疫原性。來(lái)自小鼠模型的數(shù)據(jù)證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)。
circRNA在侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用。癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散是癌癥最致命的方面。EMT是腺癌進(jìn)展的關(guān)鍵過(guò)程之一，并已被證明其由若干circRNA和circRNA生物發(fā)生因子促進(jìn)。其他已被證明促進(jìn)轉(zhuǎn)移的circRNA包括分別來(lái)自小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌中FLI1（FECR）和EML4–ALK融合基因（F-circEA-2a）的circRNA。
circRNA作為生物標(biāo)志物的潛在效用
circRNA通常以組織特異性甚至細(xì)胞類型特異性的方式表達(dá)。此外，許多單個(gè)的circRNA在腫瘤中相對(duì)于相鄰非惡性組織有差異表達(dá)，并與某些臨床特征相關(guān)，如腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)、轉(zhuǎn)移（TNM）分期等。這些發(fā)現(xiàn)突出了circRNA作為有前途的診斷和預(yù)后生物標(biāo)記物的重要性，其在生物流體（如血漿、唾液和尿液）中的高穩(wěn)定性和可檢測(cè)性進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。
circRNA作為預(yù)后生物標(biāo)志物。ciRS-7被認(rèn)為是通過(guò)在癌細(xì)胞中海綿化miR-7而發(fā)揮癌基因的功能，并與大多數(shù)癌癥類型的預(yù)后不良有關(guān)。然而，2020年公布的數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)典癌基因驅(qū)動(dòng)型腺癌的癌細(xì)胞中完全沒(méi)有這種circRNA。雖然這些發(fā)現(xiàn)似乎相互矛盾，但ciRS-7在位于這些腫瘤內(nèi)的基質(zhì)細(xì)胞中非常豐富，并且在包括結(jié)腸、乳腺和肺在內(nèi)的多種腺癌中，高比例的基質(zhì)細(xì)胞是一個(gè)強(qiáng)有力的獨(dú)立預(yù)后因素。在一些研究中被認(rèn)為是預(yù)后生物標(biāo)志物的其他circRNAs包括circUBAP2和circLARP4。盡管circRNA的 panels或signatures被證明可能是更可靠的生物標(biāo)志物，但是單獨(dú)的circRNA也可能具有預(yù)后價(jià)值。
circRNA作為診斷生物標(biāo)記物。有證據(jù)表明circRNA具有區(qū)分癌癥亞型的潛力，這通常有助于指導(dǎo)治療決策。例如，在非小細(xì)胞肺癌中，circACVR2A的低表達(dá)和circCCNB1的高表達(dá)可能分別有助于區(qū)分腺癌和鱗狀細(xì)胞癌。此外，circRNAs也可以被非侵入性地檢測(cè)，并可能被用于診斷。
circRNA作為預(yù)測(cè)性生物標(biāo)記物。通過(guò)預(yù)測(cè)對(duì)治療的反應(yīng)，circRNA可以幫助臨床醫(yī)生在限制毒性的同時(shí)實(shí)現(xiàn)最佳患者結(jié)局。例如在乳腺癌和前列腺癌中，可以通過(guò)測(cè)量特定circRNA的表達(dá)水平來(lái)預(yù)測(cè)內(nèi)分泌治療反應(yīng)。circRNA的表達(dá)水平也可能有助于預(yù)測(cè)對(duì)各種化療藥物的反應(yīng)。例如，在鼻咽癌患者中，基于circCRIM1表達(dá)和N分期，可以預(yù)測(cè)對(duì)含多西紫杉醇的誘導(dǎo)化療的不同反應(yīng)。此外，臨床前研究表明，circRNA也在免疫治療抵抗中發(fā)揮作用。circRNA還可能用于預(yù)測(cè)未來(lái)治療的不良反應(yīng)，有數(shù)據(jù)表明circRNA作為各種毒性的保護(hù)劑或介導(dǎo)劑的功能作用。
用于早期檢測(cè)的circRNA。鑒于大多數(shù)癌癥一旦轉(zhuǎn)移就無(wú)法治愈，早期癌癥檢測(cè)是降低發(fā)病率和死亡率的關(guān)鍵。由于其高穩(wěn)定性和組織特異性表達(dá)，circRNA作為早期癌癥檢測(cè)的微創(chuàng)生物標(biāo)記物具有巨大潛力。一項(xiàng)多中心研究的數(shù)據(jù)表明，基于血漿的circRNA生物標(biāo)記物在早期檢測(cè)HCC方面表現(xiàn)良好，在區(qū)分HBV相關(guān)HCC患者與非HCC患者方面的準(zhǔn)確性高于甲胎蛋白。circRNA也被證明富含血清外小體，并具有早期診斷結(jié)直腸癌的潛力，而另一項(xiàng)研究顯示，來(lái)自血清細(xì)胞外小泡的兩種circRNA，circHIPK3和circSMARCA5,，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的早期診斷中具有強(qiáng)大的潛力。
circRNA有望作為治療靶點(diǎn)或藥物
circRNA功能喪失療法。circRNA在腫瘤發(fā)生中的既定功能作用將其確定為抗癌治療的明顯靶點(diǎn)。使用反義技術(shù)可以選擇性地抑制或降解致癌的circRNA。一種選擇是使用CRISPR–Cas9系統(tǒng)，但是涉及倫理及不可預(yù)測(cè)的選擇性剪接事件風(fēng)險(xiǎn)；可以選擇RNA干擾、CRISPR–Cas13系統(tǒng)等更常見的方式進(jìn)行。目前為止，大多數(shù)功能缺失的研究都是在臨床前動(dòng)物模型中使用RNAi進(jìn)行circRNA敲除，并且還沒(méi)有circRNA靶向治療進(jìn)入臨床試驗(yàn)。
circRNA功能獲得療法。新的癌癥治療也可能基于circRNA功能的獲得，或者通過(guò)天然腫瘤抑制因子circRNA的過(guò)度表達(dá)，或者通過(guò)含有腫瘤抑制因子的人工circRNA的表達(dá)。在臨床前研究中，最常見的方法是提供含有重復(fù)miRNA結(jié)合位點(diǎn)的circRNA，它可以作為致癌miRNA的ceRNAs。此外，circRNA所發(fā)揮的治療作用并不局限于RNA元素，還可以是蛋白質(zhì)。
鑒于大多數(shù)circRNA的表達(dá)水平非常低，并且可能是非功能性的，未來(lái)的研究應(yīng)更關(guān)注研究中circRNA的豐度。此外，作者鼓勵(lì)旨在解決作用機(jī)制和病理生理作用的研究。考慮到m6A修飾已被證明能增強(qiáng)某些circRNA的蛋白質(zhì)吸附和翻譯潛能，研究circRNA轉(zhuǎn)錄后化學(xué)修飾的功能相關(guān)性也將很重要。
盡管circRNAs在癌癥中的作用機(jī)制和病理生理作用存在爭(zhēng)議，但這些分子作為診斷、預(yù)后和預(yù)測(cè)性生物標(biāo)記物仍具有特殊的前景。
目前circRNA表達(dá)譜僅在有限數(shù)量的癌癥實(shí)體中得到全面分析，而circRNA表達(dá)譜與驅(qū)動(dòng)癌基因突變之間的關(guān)系通常知之甚少。此外，由于技術(shù)挑戰(zhàn)，缺乏單細(xì)胞水平和空間分辨率的circRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。這些研究對(duì)于理解circRNA的功能以及推動(dòng)未來(lái)生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展至關(guān)重要。
首發(fā)公號(hào)：國(guó)家基因庫(kù)大數(shù)據(jù)平臺(tái)
參考文獻(xiàn)
Kristensen L S, Jakobsen T, Hager H, et al. The emerging roles of circRNAs in cancer and oncology[J]. Nature Reviews Clinical Oncology, 2021: 1-19.
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