一、舉例回顧
本節(jié)下載GSE1009數(shù)據(jù)集，使用limma包進行差異分析舉例。
GSE1009??
樣本量：共6個樣本，其中后3個為糖尿病腎病(DN)腎小球樣本，前3個為正常腎小球樣本。
使用芯片：Affymetrix Human Genome U95 Version 2 Array。
平臺：GPL8300。
二、需要準備的文件：
上一節(jié)中保存的GSE1009.Rdata和GSE1009expressionmetrix_GSE.csv（請把這兩個文件放在一個文件夾中。）
三、差異分析代碼解析：
>setwd("D:\\Rfile")
>rm(list = ls())
>options(stringsAsFactors=F)
#老規(guī)矩，先設(shè)置工作目錄。
>load(file = 'GSE1009.Rdata')
#加載上一節(jié)保存的R文件，里面包含表達矩陣和分組信息，不記得了可以看看上一節(jié)代碼。
>table(group_list)
#計數(shù)每組樣本的個數(shù)。
>library(limma)
#調(diào)用limma包，注意調(diào)用包之前，請先安裝。
#limma包是biocondutor中的包，搜索安裝命令的方式見上一節(jié)，這里就不重復(fù)了。最新的安裝命令如下：
>logFoldChange=1
>adjustP=0.05
#設(shè)置差異基因DEGs的篩選閾值。
#關(guān)于篩選閾值：一般有三個篩選條件，log2FC、P、FDR(調(diào)整的P),大家可以根據(jù)自己的需要設(shè)置。
>rt=read.csv("GSE1009expressionmetrix_GSE.csv")
#讀取整理好的表達矩陣數(shù)據(jù)，讀入R中的矩陣的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)為列表，將整個列表賦值給變量rt.
>rt=as.matrix(rt)
#將列表rt轉(zhuǎn)換為矩陣。
#這時表達矩陣如下：
>rownames(rt)=rt[,1]
#將第一列數(shù)據(jù)（基因名）作為行名。
>exp=rt[,2:ncol(rt)]
#選擇第2列到最后一列，即表達矩陣，并賦值給exp。這樣就得到行名為基因名，列名為樣本名的矩陣。
>dimnames=list(rownames(exp),colnames(exp))
#提取出exp的行名和列名。這里的dimnames就是矩陣創(chuàng)建matrix里面的參數(shù)，在數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)矩陣那一節(jié)有講。
>rt=matrix(as.numeric(as.matrix(exp)),nrow=nrow(exp),dimnames=dimnames)
#合并整個矩陣，得到一個行名為基因名，列名為樣本名的表達矩陣。
>modType=c(rep("Control",3),rep("DN",3))
#構(gòu)建分組模型，根據(jù)GSE1009樣本的排列，前3個為正常樣本，后3個為糖腎樣本，構(gòu)建一個分組的向量模型。
>design <- model.matrix(~0+factor(modType))
>colnames(design) <- c("Control","DN")
#創(chuàng)建線性模型。
#注意這里，在構(gòu)建模型時，有一些數(shù)據(jù)集的處理組在前，對照組在后，且因為R里面默認的字符存儲順序為字母表順序，如果處理組的首寫字母的順序在對照組的后面，構(gòu)建模型時前三個又是處理組，那design出來的結(jié)果會上下調(diào)就完全相反。所以如果是這種情況的話，需要定義因子順序。如：“modType=c(rep("DN",40),rep("Control",40))
design <- model.matrix(~0+factor(modType,levels = c("DN","Control"),ordered = F)).”
>fit <- lmFit(rt,design)
>cont.matrix<-makeContrasts(DN-Control,levels=design)
>fit2 <- contrasts.fit(fit, cont.matrix)
>fit2 <- eBayes(fit2)
>allDiff=topTable(fit2,adjust='fdr',number=200000)
#貝葉斯檢驗。
>diffSig <- allDiff[with(allDiff, (abs(logFC)>logFoldChange & adj.P.Val < adjustP )), ]
#根據(jù)篩選條件篩選出差異基因。
>diffUp <- allDiff[with(allDiff, (logFC>logFoldChange & adj.P.Val < adjustP )), ]
#篩選上調(diào)的基因。
>diffDown <- allDiff[with(allDiff, (logFC<(-logFoldChange) & adj.P.Val < adjustP )), ]
#篩選下調(diào)的基因。
##如果想把這些基因的結(jié)果輸出，可以用write.table函數(shù)write.table(diffUp,file="up.xls",sep="\t",quote=F,row.names=F)，要基因名字就把參數(shù)row.names設(shè)置為T.
##繪制熱圖
>group<-modType
#設(shè)置熱圖的分組。
>group<-as.data.frame(group)
>rownames(group)<-colnames(rt)
#按照分組，將rt的列名改為DN或control
>heat<-rt[rownames(rt) %in% c(head(rownames(subset(diffSig,diffSig$logFC>0)),20),head(rownames(subset(diffSig,diffSig$logFC<0)),20)),]
>library(pheatmap)
>x <- t(scale(t(heat)))
>pheatmap(x,annotation_col=group)
#繪制前20個基因的熱圖，自己調(diào)整基因數(shù)、圖形顏色等等。
##繪制火山圖
>png(file="火山圖.png",width = 600,height = 600)
#設(shè)置圖片格式
>yMax=max(-log10(allDiff$adj.P.Val))
#定義y軸最大值
>xMax=max(abs(allDiff$logFC))
#定義x軸最大值
>plot(allDiff$logFC,-log10(allDiff$adj.P.Val), xlab="logFC",ylab="-log10(adj.P.Val)",main="Volcano", xlim=c(-xMax,xMax),ylim=c(0,yMax),yaxs="i",pch=19, cex=1.2)
#繪圖
>diffSub=subset(allDiff, adj.P.Val<adjustP & logFC>logFoldChange)
>points( diffSub$logFC,-log10(diffSub$adj.P.Val), pch=19, col="red",cex=1.2)
#修改上調(diào)基因的圖形參數(shù)
>diffSub=subset(allDiff, adj.P.Val<adjustP & logFC<(-logFoldChange))
>points(diffSub$logFC,-log10(diffSub$adj.P.Val), ?pch=19, col="green",cex=1.2)
#修改下調(diào)基因的圖形參數(shù)
>abline(h=-log10(adjustP),lty=2,lwd=2)
>abline(v=c(-1,1),lty=2,lwd=2)
#拼接圖形
>dev.off()
#返回終端。
所有代碼如下：
整個分析中的變量如下：
至此，DEGs分析以及火山圖和熱圖就完啦，下一章是富集分析。
