影響因子：6.0

研究概述：在癌癥免疫治療領(lǐng)域，具有安全性和功能特性的基于mRNA的疫苗正蓬勃發(fā)展。然而，肺腺癌 （LUAD） 的穩(wěn)定免疫分子亞型和 LUAD mRNA 疫苗開發(fā)的新型腫瘤抗原仍然難以闡述清楚。因此，迫切需要一種新的方法來識(shí)別合適的LUAD亞型和潛在的腫瘤抗原。在這項(xiàng)研究中，作者利用7種機(jī)器學(xué)習(xí) （ML） 算法通過對(duì)單細(xì)胞和組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)了LIMOC系統(tǒng)，包括三種亞型：LIMOC1、LIMOC2和LIMOC3。并在LUAD中鑒定了CHIT1、LILRA4和MEP1A作為新的腫瘤抗原。這些基因表達(dá)量上調(diào)，與APC浸潤呈正相關(guān)，有望成為mRNA疫苗的候選者。另外，LIMOC2亞型預(yù)后最差，適用于以上述三個(gè)基因?yàn)榘悬c(diǎn)的mRNA疫苗治療。其中，索拉非尼和阿扎胞苷具有作為亞型特異性治療藥物的潛力。這些發(fā)現(xiàn)有可能為mRNA疫苗的開發(fā)奠定基礎(chǔ)，并為腫瘤的精確治療提供新的思路。

LIMOC系統(tǒng)的構(gòu)建和免疫亞型的鑒定

免疫亞型可能會(huì)影響免疫治療的有效性，并為患者選擇mRNA疫苗接種提供指導(dǎo)。為了識(shí)別這些亞型，作者采用七種機(jī)器學(xué)習(xí)算法來構(gòu)建LIMOC系統(tǒng)。該分析得到三種共識(shí)亞型，分別為 LIMOC1、LIMOC2 和 LIMOC3（如圖1A）。圖2B展示了在LUAD中顯示獲得的多組學(xué)數(shù)據(jù)。作者研究了患者生存期與LUAD亞型之間的關(guān)聯(lián)。與 LIMOC1 和 LIMOC3 患者相比，LIMOC2 患者的中位 OS 明顯更短（如圖1C）。接下來，作者基于亞型特定基因，使用NTP將Meta隊(duì)列和GSE72094隊(duì)列中的樣本分為LIMOC組，兩個(gè)隊(duì)列中都觀察到類似的結(jié)果（如圖1D-E），所有的LIMOC2患者表現(xiàn)出較差的臨床結(jié)果。作者還對(duì)此分類與先前研究團(tuán)隊(duì)的分子分類之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了研究（如圖1F-K）。上述研究方法都顯示出與患者預(yù)后的相關(guān)性，所有預(yù)后差的亞型都集中于LIMOC2中，這表明作者分類方法的可靠性。例如，在Song等人的研究中，大多數(shù) LIMOC2 患者屬于預(yù)后最差的C3 組，這與作者的發(fā)現(xiàn)一致，即 LIMOC2 患者的預(yù)后最差（如圖1G）。在We等人的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果（圖1H-K）。

突變狀態(tài)與免疫亞型的關(guān)系

三種亞型與免疫治療療效相關(guān)，所以作者對(duì)三種亞型的腫瘤突變負(fù)荷（TMB）進(jìn)行了評(píng)估。LIMOC2 的 TMB 明顯更高（圖1L-M），并攜帶更多與APOBEC特征相關(guān)的突變。LIMOC2在TP53、NLRP3、TLR4和RB1等頻繁改變的基因中突變最多。除此之外， LIMOC2 的染色體不穩(wěn)定性更高，表現(xiàn)為拷貝數(shù)改變 （CNA） 的顯著增加（圖1O），在LIMOC2中，拷貝數(shù)增益主要位于8q24.21區(qū)域，在其他亞型中未擴(kuò)增。相反，已知在細(xì)胞永生化過程中，易失活的Ch9p21.3區(qū)域在LIMOC2亞型中主要變現(xiàn)為特異性缺失。

LUAD免疫亞型與調(diào)節(jié)子分析的相關(guān)性

轉(zhuǎn)錄組調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在腫瘤的發(fā)生和增殖中起著關(guān)鍵作用。因此，作者評(píng)估了 68 個(gè)染色質(zhì)重塑調(diào)節(jié)子和 23 個(gè)其他調(diào)節(jié)子的活性，以確定亞型之間的潛在差異。結(jié)果揭示了三種亞型的不同調(diào)控模式。LIMOC2患者與 Fox 基因家族相關(guān)，而 LIMOC3患者可能受雄激素受體（AR）和雌激素受體2（ESR2） 激活的影響（圖2A）。作者進(jìn)一步構(gòu)建了十種致癌途徑的特征，并使用GSVA方法計(jì)算了富集分?jǐn)?shù)。該分析顯示，在LIMOC2患者中，細(xì)胞周期和PI3K致癌途徑被激活（圖2B-C）。同樣，作者通過Meta隊(duì)列和GSE72094對(duì)列的分析發(fā)現(xiàn)，LIMOC2亞型與NRF2致癌途徑的激活相關(guān)，這表明LUAD的低免疫浸潤可能是由致癌途徑功能障礙所致。另外，LIMOC3具有較高的TGF-β和基質(zhì)成分得分，表明LIMOC3表型既具有免疫“熱”特征，又具有免疫抑制特征，這可能會(huì)阻礙主動(dòng)免疫反應(yīng)。

對(duì)不同代謝途徑激活的分析顯示出不同亞型之間的獨(dú)特模式（圖2D）。LIMOC1與精氨酸生物合成、抗壞血酸和糖醛酸代謝以及丙酮酸代謝途徑的激活相關(guān)。相反，LIMOC2與嘧啶代謝、嘧啶生物合成和維生素B6代謝的激活相關(guān)。最后，LIMOC3患者亞油酸代謝和花生四烯酸代謝途徑均顯示激活狀態(tài)。這些發(fā)現(xiàn)表明這三種亞型展現(xiàn)出獨(dú)特的代謝模式，可以作為獨(dú)特的分子特征和臨床結(jié)果，有助于患者不同亞型的識(shí)別。

LUAD亞型與臨床特征、細(xì)胞特征和分子特征的相關(guān)性

作者研究了每種LUAD亞型與的臨床特征，包括年齡、性別和腫瘤分期之間的相關(guān)性。研究結(jié)果表明，LIMOC2 亞型的患者主要為老年男性，總生存期明顯較短。接下來，作者通過ssGSEA 算法評(píng)估了 TCGA隊(duì)列、Meta-隊(duì)列 和GSE72094隊(duì)列中免疫細(xì)胞浸潤水平變化（如圖3A-C）。LIMOC2 患者的活化記憶 CD4 T 細(xì)胞浸潤水平高，而 LIMOC3患者的 CD8 T 細(xì)胞、CD4 幼稚 T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、Tregs、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞浸潤水平高。與其他亞型相比，LIMOC3 亞型的 M2 巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和 Tregs 的浸潤水平尤其高。免疫檢查點(diǎn)（ICPs）是一種可以阻止免疫系統(tǒng)識(shí)別和攻擊癌細(xì)胞的機(jī)制。作者發(fā)現(xiàn)，與其他亞型相比，LIMOC3 亞型 ICP 的基因表達(dá)量更高（圖3E、H 和 K）。鑒于免疫原性細(xì)胞死亡（ICD）調(diào)節(jié)劑在刺激抗腫瘤免疫中的關(guān)鍵作用，作者探索了這些調(diào)節(jié)劑在三種LIMOC亞型中的表達(dá)水平。作者分析了三個(gè)隊(duì)列中的 21 個(gè) ICD 調(diào)節(jié)劑，發(fā)現(xiàn)超過一半的 LIMOC2 顯著上調(diào)，包括 ANXA1、CALR、CXCL10、EIF2A、EIF2AK1、EIF2AK2、HMGB1 和 PANX1 （如圖3F、I 和 L）。

單細(xì)胞水平上三種亞型的分子特征

為了更深入地了解LUAD中的LIMOC系統(tǒng)，作者分析了一個(gè)單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)集（GSE131907）。該數(shù)據(jù)集來源于 41 個(gè)樣本，包括 27,578 個(gè)轉(zhuǎn)錄本和 191,736 個(gè)細(xì)胞數(shù)據(jù)。將數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理之后，為了更好地表征細(xì)胞組成，作者量化了細(xì)胞類型的比例（如圖4A）。其中，免疫細(xì)胞群最多，其次是上皮細(xì)胞（如圖4B）。作者從中分離出18,913個(gè)惡性細(xì)胞，根據(jù)每個(gè)惡性細(xì)胞中分類生物標(biāo)志物的歸一化表達(dá)，將 NTP 用于 LUAD 亞型。其中將6891個(gè)細(xì)胞歸類為LIMOC1，將6085 和 5937 個(gè)細(xì)胞分別歸類為LIMOC2 和 LIMOC3。作者還通過t-SNE揭示了惡性細(xì)胞的不同簇，反映了它們的亞型和樣本來源（如圖4C-E）。LIMOC1腫瘤細(xì)胞主要富集于mBrain中，LIMOC2腫瘤細(xì)胞主要富集于tL/B中，LIMOC3腫瘤細(xì)胞富集于mLN中。這些發(fā)現(xiàn)也表明侵襲性腫瘤內(nèi)腫瘤異質(zhì)性更大（如圖4F）。

接下來，作者對(duì)十個(gè)致癌通路進(jìn)行了GSVA分析以計(jì)算富集分?jǐn)?shù)。與先前的結(jié)果一致，在LIMO2亞型中細(xì)胞周期被激活，而TGF-β通路在LIMOC1和LIMOC3中被激活（圖4G）。同時(shí)，惡性細(xì)胞中三個(gè)亞型的代謝模式也與上述結(jié)果趨勢一致（圖4H）。作者還對(duì)ICP和ICD調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平進(jìn)行了探索。正如預(yù)期的那樣，LIMOC3中ICP均高表達(dá)，而近一半的ICD調(diào)節(jié)因子在LIMOC2中上調(diào)，包括CXCL10、EIF2AK2、HMGB1和ANXA1。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)了先前結(jié)果的可靠性（如圖4I-J）。

LUAD中新型候選抗原篩選

為了篩選出LUAD中新型的腫瘤抗原。首先，作者通過整合TCGA和GTEx數(shù)據(jù)，確定了潛在編碼腫瘤抗原的1897個(gè)上調(diào)基因，調(diào)控基因的染色體分布（如圖5A）。其次，識(shí)別了12501個(gè)突變基因，其中前20個(gè)基因顯示在圖5B中。最后，基于CNV數(shù)據(jù)選擇了15063個(gè)擴(kuò)增基因，其中前10個(gè)擴(kuò)增基因顯示在圖5C中。作者在結(jié)合表達(dá)、突變和拷貝數(shù)數(shù)據(jù)后，共獲得935個(gè)高表達(dá)、突變和擴(kuò)增基因作為有前景的候選腫瘤抗原。在TCGA數(shù)據(jù)集中，識(shí)別了3088個(gè)與OS相關(guān)的基因作為mRNA疫苗靶標(biāo)的關(guān)鍵基因。此外，作者考慮到APC在免疫中的作用，還探究了基因表達(dá)和APC豐度之間的關(guān)系，共得到987個(gè)與APC水平強(qiáng)相關(guān)的基因。最后，通過交叉分析所有三個(gè)數(shù)據(jù)集（表達(dá)、突變/擴(kuò)增、和APC相關(guān)性），確定了三個(gè)LUAD候選腫瘤抗原：CHIT1、LILRA4和MEP1A（如圖5D）。這三個(gè)候選腫瘤抗原與LUAD患者OS和PFS顯著相關(guān)（如圖5E-J）。這表明這些基因在LUAD的發(fā)展和進(jìn)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。作者在含有人類LUAD組織的組織微陣列（TMAs）上進(jìn)行了免疫組化，以確定上述候選抗原在蛋白水平上的變化。與先前的結(jié)果一致，與癌旁組織相比，CHIT1、LILRA4和MEP1A在LUAD組織中的表達(dá)均顯著上調(diào)（圖5K-P）。此外，還進(jìn)行了siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)CHIT1、LILRA4和MEP1A的沉默抑制了LUAD細(xì)胞系A(chǔ)549的增殖，且這種抑制效果是時(shí)間依賴的（圖5Q）。上述研究結(jié)果表明，CHIT1、LILRA4和MEP1A在LUAD中上調(diào)，并且與基因突變、擴(kuò)增和APC浸潤相關(guān)。這表明，針對(duì)這三個(gè)基因的mRNA疫苗可能會(huì)誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)并消滅癌細(xì)胞。

LIMOC2亞型中APC標(biāo)記物與這三個(gè)抗原之間的相關(guān)性

綜合上述所有結(jié)果發(fā)現(xiàn)， LIMOC2 亞型的患者可能更適用于以 CHIT1、LILRA4 和 MEP1A 為靶點(diǎn)的 mRNA 疫苗。為了進(jìn)一步研究，作者對(duì)APC 標(biāo)記物和 LIMOC2 亞型內(nèi)的三種候選抗原之間的mRNA表達(dá)量進(jìn)行了相關(guān)性分析。研究結(jié)果表明，CHIT1與LILRA4 與 CD40、CD80和CD86呈正相關(guān)。在Meta隊(duì)列和GSE72094隊(duì)列中也觀察到了相同的結(jié)果（如圖6A-B，D-E，G-H）。然而，MEP1A 與CD40、CD80和CD86在三種隊(duì)列中并不是全部相關(guān)。綜上所述，在LIMOC2 亞型患者中，這三個(gè)抗原，尤其是CHIT1與LILRA4，和APC 標(biāo)記物顯著相關(guān)（如圖6C，F(xiàn)，I）。

LUAD中三種腫瘤抗原的潛在生物學(xué)價(jià)值

為了闡明三種候選抗原（CHIT1、LILRA4 和 MEP1A）發(fā)揮作用的潛在機(jī)制，作者進(jìn)行了相關(guān)通路富集分析。結(jié)果表明，CHIT1在免疫相關(guān)通路，包括“Th17細(xì)胞分化”、“趨化因子信號(hào)通路”和“細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用”（如圖6J，M）中富集。LILRA4主要富集于“免疫效應(yīng)過程的調(diào)節(jié)”、“細(xì)胞因子產(chǎn)生的正調(diào)控”和“T細(xì)胞活化”（如圖6K，N）等生物學(xué)過程。MEP1A主要富集于“B細(xì)胞受體信號(hào)通路”和“細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用”（如圖6L，O）等通路。這些結(jié)果表明，CHIT1、LILRA4和MEP1A與免疫生物學(xué)過程有關(guān)，為開發(fā)靶向這些基因的mRNA疫苗提供了基礎(chǔ)。

亞型特異治療藥物的篩選和驗(yàn)證

鑒于LIMOC2亞型患者的預(yù)后差，所以探索亞型特異性治療至關(guān)重要。在這項(xiàng)研究中，作者采用綜合方法來識(shí)別適用于LIMOC2患者的潛在治療藥物（如圖7A）。首先，作者從三個(gè)獨(dú)立的藥物反應(yīng)數(shù)據(jù)集（CTRP、GDSC和PRISM）下載數(shù)據(jù)。并利用pRRophetic軟件包中的calcPhenotype函數(shù)來估計(jì)每個(gè)LUAD患者對(duì)每種藥物在每個(gè)數(shù)據(jù)集中的敏感性。最后，使用“l(fā)imma”包對(duì)三個(gè)亞型之間的不同敏感性進(jìn)行分析。這項(xiàng)分析確定了幾種潛在的LIMOC2特異性藥物：在CTRP中有136種、GDSC中有66種、PRISM中有269種（如圖7B）。然后，作者選擇至少在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中均被顯著識(shí)別的藥物作為LIMOC2特異性藥物，最終篩選出28種潛在治療候選藥物（如圖7C）。為了進(jìn)一步縮小候選藥物的范圍，作者通過文獻(xiàn)檢索在治療LUAD中有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以及臨床數(shù)據(jù)的化合物作為候選藥物，以及在CMap 數(shù)據(jù)集中與 LUAD 中通常觀察到的基因表達(dá)模式相反的化合物作為候選藥物，最終鑒定索拉非尼和阿扎胞苷對(duì)LUAD具有潛在治療效果（如圖7D）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證索拉非尼和阿扎胞苷的治療潛力，作者使用四種LUAD細(xì)胞系進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)：NCI-H1395、NCI-H2347、HCC827和Calu-3。根據(jù)NTP預(yù)測結(jié)果，NCI-H1395和Calu-3分別歸屬于LIMOC1樣亞型和LIMOC3樣亞型，而HCC827和NCI-H2347則歸類為LIMOC2樣亞型。索拉非尼和阿扎胞苷的細(xì)胞活力測定結(jié)果與預(yù)測結(jié)果一致（如圖7E-F），證明這兩種化合物可能是治療LIMOC2患者的潛在治療藥物。

研究總結(jié)：

這項(xiàng)研究將LUAD患者區(qū)分為不同的免疫亞型，并篩選出針對(duì)LUAD的mRNA疫苗腫瘤抗原。基于單細(xì)胞以及組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，作者利用7種機(jī)器學(xué)習(xí)算法，將LUAD患者分為三種免疫亞型：LIMOC1、LIMOC2、LIMOC3。將 CHIT1、LILRA4 和 MEP1A 確定為針對(duì) LUAD 的 mRNA 疫苗的新型腫瘤抗原。LIMOC2 亞型患者是一種獨(dú)特的免疫亞型，與患者預(yù)后不良顯著相關(guān)，適應(yīng)于以CHIT1、LILRA4 和 MEP1A為靶點(diǎn)的mRNA免疫治療。并且發(fā)現(xiàn)，索拉非尼和阿扎胞苷可以作為LIMOC2 亞型的潛在治療藥物。本研究為為LUAD的個(gè)性化治療提供了寶貴的思路，并有望改善患者的治療效果。