前言

胞葬作用（吞噬細胞清除程序性死亡的細胞）對控制腫瘤生長一定是有利的嗎？這可未必，最近剛發表在nature cancer上題為：Efferocytosis reprograms the tumor microenvironment to promote pancreatic cancer liver metastasis的文章，揭示了胞葬作用在促進胰腺導管癌（PDAC）肝轉移過程中的作用，并發現通過藥物阻斷胞葬作用或者巨噬細胞特異性的顆粒蛋白前體耗竭會損害巨噬細胞向免疫抑制型轉化，進而改善CD8+ T細胞功能，減少肝轉移。

主要內容

1. 轉移性肝臟中的巨噬細胞多種多樣

首先，為了研究 PDAC 晚期轉移灶的免疫學狀態，作者從未經治療的 PDAC 轉移性患者中收集了新鮮的肝活檢樣本，并進行了bulk RNA-seq。結果說明轉移性病灶是免疫沉默的，富含巨噬細胞和中性粒細胞，而T細胞、B細胞和自然殺傷細胞較少。

為了表征體內胰腺癌肝轉移中的轉移相關巨噬細胞（MAM）的異質性，作者分析了來自健康肝臟（2,428 個細胞）、早期轉移灶（2,007 個細胞）、晚期近端轉移灶（1,953 個細胞）和晚期遠端轉移灶（2,783 個細胞）的巨噬細胞，并進行了聚類和降維等分析。

圖1：scRNA-seq聚類和降維分析以及marker基因分布情況

庫普弗細胞 (KC) 和單核細胞來源的巨噬細胞 (MoM) 構成肝臟中的巨噬細胞群。簇0, 1, 4, 5, 6, 8和9顯示了 KC標志物的高表達，例如Clec4f、Vsig4和Timd4。同時，簇2, 3和7高表達單核細胞來源的巨噬細胞標志物Ccr2。

在無腫瘤肝臟中，KC 亞群在巨噬細胞群體中占主導地位，尤其是占群體75% 的簇0。在有轉移性病變的肝臟中，KC簇1, 4, 6和8以及所有三個MoM簇與無腫瘤肝臟相比均有增加，因此被鑒定為轉移相關的巨噬細胞。

圖2：不同肝臟狀態下巨噬細胞分布情況

接下來，作者對MoM群體（簇2, 3和7）進行了額外的聚類和降維，并發現了6個不同的MoM簇。其中C簇與吞噬/凋亡細胞清除基因（Cd300a, Cd36, Scarb1, Anxa2和Gpnmb）相關，并富含溶酶體基因（Lipa, Ctsb, Ctsd, Psap和Grn）。CD74 ?/low YM-1?（簇C）在早期轉移性病灶中最豐富，而CD74 ?/low YM-1+（簇A）代表晚期轉移性病灶中最常見的MoM亞群。通過與CD8+T細胞的共培養實驗，作者觀察到晚期腫瘤的CD74 ?/low的免疫抑制活性低于早期CD74 ?/low。這可能歸因于晚期CD74 ?/low表達T細胞刺激因子（例如Il1a和Tnf）。總的來說，研究表明免疫抑制表型是MoM在轉移早期獲得的，并且與 CD74表達的喪失和胞葬作用相關基因的存在相關。

圖3：MoM再次聚類和降維

2. 胞葬作用介導了免疫抑制型

為了探究胞葬作用與免疫抑制表型間的關系，首先作者推斷，MoM中觀察到的通路特征可能與轉移引起的肝細胞損傷有關。并且在實驗中證實，在PDAC肝轉移早期，肝組織出現壞死，并出現了巨噬細胞的吞噬現象。早期的CD74-low巨噬細胞表現出免疫抑制活性，這與其表達的免疫抑制基因Arg1有關。研究還發現，使用Arg1抑制劑CB1158（ARGi）可以消除巨噬細胞的免疫抑制效應，這表明Arg1在調節早期和晚期CD74-low巨噬細胞的免疫抑制作用中起關鍵作用。

圖4：ARGi處理消除了巨噬細胞的免疫抑制效應

接下來，作者使用了一種酪氨酸蛋白激酶Mer（MerTK）的抑制劑UNC2250（MerTKi）在體外阻斷了胞葬作用。預期地，MerTKi減少了與凋亡胸腺細胞共培養的巨噬細胞的胞葬作用，并消除了巨噬細胞中Arg1表達的誘導。此外，MerTKi減少了具有胞葬作用的巨噬細胞的T細胞抑制活性。為了驗證這些發現，作者通過在小鼠體內植入KPC細胞誘導肝轉移，并連續7天給予MerTKi治療。結果顯示，在MerTKi治療的小鼠中，早期轉移病灶的肝組織壞死區域顯著增加，表明由于胞葬作用受損而延遲了凋亡細胞的清除。MerTKi治療并未影響早期轉移病灶的腫瘤負荷，但在晚期階段發現顯著減少。

圖5：MerTKi處理削弱了巨噬細胞的Arg1表達和T細胞抑制活性

3. 顆粒蛋白前體缺失可減少 PDAC 肝轉移

由于阻礙壞死細胞的清除會導致組織損傷增加，所以干預胞葬作用的后期階段可能是抑制PDAC肝轉移過程中巨噬細胞極化的更好策略。作者分析了早期簇2 MoM中上調的溶酶體基因，并確定了顆粒蛋白前體（Grn）可能作為潛在的靶點。實驗結果表明，顆粒蛋白前體在胞葬作用誘導的巨噬細胞轉化中起到關鍵作用，其缺失可減少肝轉移腫瘤負荷并降低巨噬細胞中Arg1的表達。此外，在巨噬細胞中缺乏顆粒蛋白前體也導致CD8+T細胞數量的顯著增加，促進了免疫反應。

圖6：Grn KO降低Arg1表達，增加CD8+T細胞

4. 顆粒蛋白前體缺失損害溶酶體酸化

顆粒蛋白前體缺陷型巨噬細胞（Grn KO）顯示出被吞噬的凋亡細胞的積累增加，并且溶酶體中的貨物保留增加的現象。這表明，顆粒蛋白前體缺陷型巨噬細胞攝取凋亡細胞，但溶酶體貨物加工受損。進一步，作者根據之前有關顆粒蛋白前體通過影響溶酶體酸化來調節吞噬作用的報道，測量了WT型和Grn KO型在胞葬作用期間的溶酶體酸化。在WT型巨噬細胞中，溶酶體內的pH值迅速降低，溶酶體酸化增加，但在Grn KO型巨噬細胞中并未發現該現象。溶酶體降解后產生的脂質會被核固醇受體如：LXR所感知，且LXR之前被報道可以調控Arg1基因的表達。LXRi的藥理學抑制消除了WT型巨噬細胞中Arg1的表達，但對Grn KO型巨噬細胞沒有額外影響。此外，在WT型中LXR的活性要高于Grn KO型巨噬細胞。胞葬作用信號的受損與抗腫瘤I型干擾素免疫反應有關。作者發現，顆粒蛋白前體的耗竭顯著增加I型干擾素反應的激活，這表現為核內IRF3水平的升高和Ifnb1表達的上調。

圖7：Grn KO巨噬細胞攝取凋亡細胞，但溶酶體貨物加工受損

5. 顆粒蛋白前體通過CFTR調節溶酶體酸化

作者進一步分析了與顆粒蛋白前體相互作用的潛在結合分子，并發現囊性纖維化跨膜傳導調節因子（CFTR）是其中之一。此外，作者還通過實驗確定了顆粒蛋白前體與CFTR在WT型巨噬細胞的細胞質中共定位，缺乏顆粒蛋白前體會降低溶酶體中CFTR的水平，而CFTR的表達水平保持不變。使用 CFTRinh172（CFTRi）對CFTR的藥理抑制會損害巨噬細胞中胞葬作用誘導的溶酶體酸化。此外，體外CFTR抑制顯著降低了Arg1的表達，并消除了WT型巨噬細胞免疫抑制活性的增加，但對Grn KO型巨噬細胞沒有任何影響。

圖8：CFTRi降低Arg1表達，消除WT型巨噬細胞免疫抑制活性的增加

為了評估CFTR抑制對PDAC肝轉移的影響，作者對KPC來源的癌細胞進行了脾內植入，并用CFTRi進行連續七天的治療。結果表明，CFTR抑制可以顯著降低晚期的腫瘤負擔，降低早期轉移腫瘤內MoM的Arg1表達水平，增加了CD8+T細胞浸潤和激活（GzmB+ CD8+ ; CD69+ CD8+T細胞）。總之，顆粒蛋白前體通過CFTR調節巨噬細胞中的溶酶體酸化，并且使用CFTR抑制劑對溶酶體酸化進行藥理阻斷可抑制PDAC肝轉移生長。

圖9：CFTR抑制增加了CD8+T細胞浸潤和激活

總結

總之，作者通過研究表明，PDAC發生肝轉移的腫瘤細胞定植伴隨著低度的組織損傷，從而引起巨噬細胞通過胞葬作用對死亡細胞進行清除，而這個過程會促進巨噬細胞功能重編程和進一步肝轉移。此外，作者還通過實驗證實干擾巨噬細的胞葬作用或其下游信號事件，可以抑制巨噬細胞的免疫抑制功能并恢復其抗腫瘤免疫。靶向巨噬細胞的胞葬作用可能是治療轉移性PDAC的一種新型潛在方案。

圖10：干擾胞葬作用可以削弱巨噬細胞免疫抑制功能

sciclick有話說：

該研究從bulk RNA-seq起手，發現轉移性病灶中是免疫信號被明顯抑制。進一步通過scRNA-seq表征轉移相關的巨噬細胞的異質性，層層遞進篩選出單核細胞來源的巨噬細胞 (MoM)中的一個亞群，發現該亞群與吞噬/凋亡細胞清除基因相關，并富含溶酶體基因，因此推斷胞葬作用與肝轉移密切相關。接下來，作者通過干擾巨噬細胞的胞葬作用或其下游信號事件，證實了胞葬作用的受損會抑制巨噬細胞的免疫抑制功能并恢復其抗腫瘤免疫。總之，作者首先通過生信分析手段縮小搜索范圍，確定細胞亞群和其marker基因的功能，進一步設計相關實驗進行驗證，是一個可以學習借鑒的干濕結合的典范。