生物學(xué)中最基本的問題之一就是哪種類型的細(xì)胞以功能協(xié)調(diào)的方式形成不同的組織和器官，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)使得科研人員可以在單細(xì)胞分辨率下研究細(xì)胞表型和細(xì)胞行為。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)最有吸引力的應(yīng)用之一是解碼復(fù)雜的細(xì)胞異質(zhì)性，并創(chuàng)建不同組織/器官中所有細(xì)胞類型的綜合細(xì)胞圖譜。
隨著單細(xì)測(cè)序技術(shù)的日漸成熟，越來越多研究開始選擇并利用單細(xì)胞測(cè)序，使得其成為研究生物學(xué)問題的有利工具。單細(xì)胞測(cè)序最基本，也是最核心的分析為細(xì)胞群體聚類，常見的表現(xiàn)形式是t-SNE或U-MAP聚類，在細(xì)胞聚類的基礎(chǔ)上分析細(xì)胞間基因表達(dá)差異、細(xì)胞分化時(shí)序或者發(fā)現(xiàn)鑒定罕見/新細(xì)胞群體。
因此，根據(jù)細(xì)胞的特征性基因和特征性生物學(xué)功能去定義每一個(gè)細(xì)胞群體，是單細(xì)胞測(cè)序最關(guān)鍵的部分。細(xì)胞屬性定義常用的策略是基于大量實(shí)驗(yàn)或者參考大量文獻(xiàn)，挖掘不同細(xì)胞群體的特征性表達(dá)基因，此方法雖然準(zhǔn)確但比較耗費(fèi)時(shí)間，是否有一種數(shù)據(jù)庫(kù)，可以讓我們可以查看不同細(xì)胞群體的marker基因，或者輸入輸入一個(gè)基因，數(shù)據(jù)庫(kù)就可以告訴我們?cè)摶驅(qū)儆谀姆N組織、哪種細(xì)胞呢？
發(fā)表在2019年1月NAR上的CellMarker數(shù)據(jù)庫(kù)收錄了158種組織/亞組織的467種人細(xì)胞類型， 81種組織/亞組織的389種鼠細(xì)胞類型。數(shù)據(jù)主要來源于文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)，包括單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)和生物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。不過這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)主要面向人類和小鼠。
我們這幾年也開始嘗試在煙草上的單細(xì)胞研究，但是在做的過程中遇到好幾個(gè)問題：原生質(zhì)體的制備細(xì)胞活性有時(shí)候不夠，現(xiàn)有軟件分析多倍體尤其是重復(fù)序列較多的時(shí)候不夠理想，cluster需要不斷調(diào)整（最優(yōu)不太好確定），cluster label的時(shí)候marker基因挖掘很是繁瑣，cluster label現(xiàn)有的工具準(zhǔn)確性還很欠缺等等。其中一個(gè)工作就是，為了解決cluster annotation這一耗時(shí)和繁瑣的工作，我們?nèi)ツ昃烷_始思考，能不能自己建立一個(gè)專門面向植物的marker gene數(shù)據(jù)庫(kù)，一是方面自己，同時(shí)也方面研究植物單細(xì)胞的人。也很幸運(yùn)，經(jīng)過多輪審稿，前2天最終被NAR accept了（PCMDB:a curated and comprehensive resource of plant cell markers ?【http://www.tobaccodb.org/pcmdb/homePage】?）。
數(shù)據(jù)來源
PCMDB數(shù)據(jù)主要有三類來源：實(shí)驗(yàn)相關(guān)的文獻(xiàn)挖掘，單細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)的可能marker基因，以及一些tissue/cell研究發(fā)現(xiàn)的顯著差異marker基因。
一致性和擴(kuò)展性
為了不同物種和不同研究之間的可比性，以及日后的擴(kuò)展性考慮，我們對(duì)于cell的層級(jí)機(jī)構(gòu)和命名采用Plant Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)中的格式。
通過cell和物種名字以及關(guān)鍵詞搜索，初步的獲取了125,490篇文獻(xiàn)，其中31,967篇擬南芥的，17,945篇水稻的，16,552篇玉米的，11,593篇大豆的，10,150篇番茄的和37,283篇煙草的。然后各個(gè)專家通過粗略的查看摘要和全文，例如選取有GFP，GUS染色等等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的，最后獲得擬南芥2883篇，水稻996篇，玉米649篇，大豆336篇，番茄277篇和272篇煙草的。最后再仔細(xì)查看全文以及相應(yīng)物種的官方注釋信息efp表達(dá)等等，或者marker基因的相關(guān)所需信息。（PS：這一步也是我們收集數(shù)據(jù)最耗時(shí)的步驟）
對(duì)于單細(xì)胞文獻(xiàn)，主要是關(guān)鍵詞挖掘（“single cell,” “single cell sequencing,” “single cell RNA sequencing,” “single cell RNA-seq,” “single cell RNA seq,” “single cell transcriptome,” “single cell transcriptomics,” and “scRNA seq”?等）。最終獲取擬南芥14篇，水稻3篇，玉米3篇和番茄1篇。單細(xì)胞的maker gene主要是來自文章的附表。但是由于cluster結(jié)果不能獲取，所以我們對(duì)于每個(gè)單細(xì)胞數(shù)據(jù)又重新自己進(jìn)行了分析和聚類，來做可視化顯示用。
對(duì)于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的獲取，沒什么特別的地方，也是關(guān)鍵詞挖掘（genomewide/genome-wide,” “transcriptome,” “l(fā)andscape,” and “global”等）。只不過這個(gè)數(shù)據(jù)和關(guān)鍵詞搜索的結(jié)果noise較高，需要手動(dòng)的進(jìn)行過濾，比如通過title和abstract過濾掉基因家族研究等非tissue/cell level大轉(zhuǎn)錄組的文章。然后提取附表，沒有附表的自己下載原始數(shù)據(jù)進(jìn)行重分析。
最終獲得的marker基因數(shù)據(jù)量信息如下圖所示。
在我們基本快做完的時(shí)候，2021年5月4日，浙江大學(xué)樊龍江教授團(tuán)隊(duì)在Molecular Plant發(fā)表了題為“PlantscRNAdb: A Database for Plant Single-cell RNA Analysis”論文，介紹了他們剛剛建立的植物單細(xì)胞RNA（scRNA）分析數(shù)據(jù)庫(kù)“PlantscRNAdb”。PlantscRNAdb數(shù)據(jù)庫(kù)涵蓋了已開展單細(xì)胞研究的4個(gè)模式植物（擬南芥、水稻、番茄和玉米），提供了多種來源的細(xì)胞類型標(biāo)記基因信息，如早期實(shí)驗(yàn)、RNA-Seq和scRNA-Seq等途徑獲得的標(biāo)記基因。另外，為明確來自單細(xì)胞數(shù)據(jù)標(biāo)記基因的可信度等級(jí)，樊龍江團(tuán)隊(duì)重新分析scRNA數(shù)據(jù)，并將鑒定出的標(biāo)記基因進(jìn)行了分類：當(dāng)特定細(xì)胞類型中某個(gè)標(biāo)記基因的讀序數(shù)占該基因讀序總數(shù)的80％以上時(shí)，即該標(biāo)記基因的表達(dá)主要由這一特定細(xì)胞類型貢獻(xiàn)，記為“Marker＃1”（即“Marker80”），否則記為“Marker＃2”。
整體來說，設(shè)計(jì)理念和我們是類似的，我們也就是多了2個(gè)物種。詳細(xì)來看，我們發(fā)現(xiàn)：1）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的marker gene部分（我們最耗時(shí)的部分），他們的marker基因的數(shù)量和文獻(xiàn)的數(shù)量非常有限，他們文章中描述是通過查看GFP expression等。但是如果僅僅是利用這個(gè)關(guān)鍵詞，我覺得操作起來貌似很困難，邏輯也不太通。所以進(jìn)行overlap分析后發(fā)現(xiàn)，他們中的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的marker基因幾乎95%都是包括在我們的數(shù)據(jù)集中的。從數(shù)量上，我們也是比他們多出很多的；2）有些物種無法比較，因?yàn)楸热缬衩缀痛蠖?，?shù)據(jù)庫(kù)中給出的僅僅是基因名字，沒有官方的ID等信息，從這一點(diǎn)上對(duì)于后續(xù)的使用和擴(kuò)展也是不方面的；3）cell上也沒法進(jìn)行對(duì)比，因?yàn)樗麄儾捎玫腸ell命令比較凌亂，無法進(jìn)行對(duì)照和對(duì)比。但是樊老師團(tuán)隊(duì)工作先于我們發(fā)表，對(duì)于我們還是影響很大的。沒辦法，工作被搶發(fā)，也不是第一次碰到了，科研也是競(jìng)爭(zhēng)非常慘淡的，只能發(fā)掘自己工作其它的亮點(diǎn)了，尤其是不再是第一個(gè)的時(shí)候。
因此，雖然樊老師團(tuán)隊(duì)已經(jīng)進(jìn)行了發(fā)表，我們覺得我們的工作還是有很大的優(yōu)勢(shì)的，最大的劣勢(shì)就是不是第一個(gè)這樣的工作了，這個(gè)比較遺憾。
從功能的層面，我們也進(jìn)行了提升，比如多元化的搜索和展示工具。詞云圖，marker基因在幾個(gè)物種中的efp表達(dá)值展示，以及對(duì)于有轉(zhuǎn)錄組和single-cell數(shù)據(jù)的bar圖以及U-MAP和t-SNE展示。
除了常規(guī)的好看好用的搜索和展示工具之外，我們?cè)O(shè)計(jì)之處就是為了方面用戶進(jìn)行cluster annotation的。所以我們就想怎么方面用戶的這一需求。我們測(cè)試了目前常見的cluster annotation工具，最后在線的支持了2個(gè)：SCSA和singleR，因?yàn)檫@2個(gè)對(duì)于資源的需求較小，運(yùn)行時(shí)間較短，其它常見的比如：Garnett，SingleCell Net, Cell-ID，scCATCH等。但是即便如此，我覺得這一步的結(jié)果還是提升的空間很大，方法部分還是很欠缺的。
當(dāng)然，我們這個(gè)庫(kù)還是有很多l(xiāng)imitation的，就不詳細(xì)敘述了，歡迎感興趣的多使用，給我們多提意見，多citation我們的work。
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