文獻(xiàn)
2023
Science China Life Sciences
Telomere-to-telomere genome of the allotetraploid legume Sesbania cannabina reveals transposon-driven subgenome divergence and mechanisms of alkaline stress tolerance
課題背景
（1）全球范圍內(nèi)，土壤鹽堿化普遍存在。堿性土壤pH值高，離子濃度高，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏，限制了大多數(shù)植物的生長(zhǎng)。將堿地轉(zhuǎn)化為可利用的農(nóng)業(yè)用地為改善全球糧食生產(chǎn)和安全提供了機(jī)會(huì)。幾千年來(lái)，在傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)中，綠肥一直被用來(lái)提高土壤肥力，施用綠肥是改善鹽堿地的一種有效方法。綠肥作物有助于保持土壤肥力，減少有害化學(xué)品的使用，促進(jìn)可持續(xù)農(nóng)業(yè)。
（2）田菁屬 (Sesbania sp.)屬于豆科，約52種，分布于全球熱帶和亞熱帶地區(qū)。異源四倍體田菁 (Sesbania cannabina, 2n=4x=24)是一種快速生長(zhǎng)的草本植物，由于其出色的耐堿性土壤和固氮能力，已被用作綠肥以提高土壤肥力，此外，它也作為牛、綿羊和山羊的飼料具有很高的價(jià)值。因此，S. cannabina在改良和利用堿性土壤方面具有巨大潛力。目前，在田菁屬植物中，只有極少數(shù)進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化研究，S. drummondii和S. rostrata?但是它們的轉(zhuǎn)化效率仍然很低，迫切需要開(kāi)發(fā)更合適的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。?
（3）基因組序列信息有助于我們對(duì)田菁逆境耐受性和基因組演化過(guò)程的理解。近年來(lái)測(cè)序和組裝技術(shù)的進(jìn)步使得獲取完整的基因組組裝成為可能，徹底改變了基因組學(xué)研究和育種的方式。目前已經(jīng)為擬南芥、葡萄、水稻和玉米等作物構(gòu)建了端粒到端粒（T2T）的基因組。這些T2T基因組提供了對(duì)重復(fù)序列、基因注釋和基因組變異的全面、全基因組范圍的評(píng)估。然而到目前為止，還沒(méi)有研究田菁的基因組進(jìn)化、異源四倍體歷史和耐堿機(jī)制。
亮點(diǎn)
在這項(xiàng)研究中，作者利用三代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行混合組裝，得到了第一個(gè)田菁的T2T基因組。基于此，作者深入探討了田菁基因組的演化，包括亞基因組的排列、異源多倍體化和LTR-RTs驅(qū)動(dòng)的亞基因組分化，并鑒定到四個(gè)田菁特異性的與堿性條件相應(yīng)相關(guān)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，突顯了它們?cè)谟N中增強(qiáng)作物適應(yīng)堿性土壤磷酸鹽缺乏的潛力。
結(jié)論1?田菁可以改善堿性土壤
Fig 1
為了找到在堿性土壤中生長(zhǎng)的綠肥作物，作者在中國(guó)東北地區(qū)的田間條件下，對(duì)來(lái)自13個(gè)物種的18個(gè)綠肥種質(zhì)進(jìn)行了篩選。在這些種質(zhì)中，豆科植物田菁（S. cannabina）表現(xiàn)出對(duì)堿性條件的強(qiáng)大耐受性，甚至在pH>10的堿性土壤中表現(xiàn)出27%-49%的幼苗出苗率，可以在pH>10的土壤中生長(zhǎng)（Fig 1A）。為了進(jìn)一步證實(shí)這一點(diǎn)，作者使用堿性土壤（pH約9.7）和黑土壤（pH約7.2）進(jìn)行了盆栽實(shí)驗(yàn)，以比較田菁和中度堿性耐受的豆科植物苜蓿（Medicago sativa）之間的堿性耐受性。結(jié)果表明，在堿性土壤中，苜蓿未能存活，但田菁展示出強(qiáng)健的長(zhǎng)勢(shì)（Fig 1B）。這些結(jié)果表明田菁具有強(qiáng)大的堿性耐受性。
此外，作者發(fā)現(xiàn)田菁在田間強(qiáng)堿性土壤中能夠結(jié)瘤，具有固氮活性（Fig1C），表明它可能改善堿性土壤。為了探討這一點(diǎn)，作者評(píng)估了在田菁植株長(zhǎng)到1.5-2米高后，在收獲地上部生物量為24 t/ha后犁地的效果。經(jīng)過(guò)一輪犁地并將根茬歸還田地后，土壤pH顯著降低了近0.5個(gè)單位，電導(dǎo)率（EC）顯著降低了22.68%，土壤有機(jī)碳（SOC）大幅增加了25.65%（Fig 1D-F），這些結(jié)果表明大麻木對(duì)改良?jí)A性土壤是有益的。
結(jié)論2?田菁的基因組組裝和注釋
Fig 2A-C
為更好地了解田菁高堿性耐受性的分子基礎(chǔ)，作者對(duì)LJ5種質(zhì)進(jìn)行了測(cè)序和組裝。使用310.80 Gb（約155×）的Hi-C數(shù)據(jù)，將大的contig錨定并定向到12個(gè)偽染色體上，與核型分析的結(jié)果一致（Fig 2A-B）。為構(gòu)建T2T基因組組裝，作者通過(guò)將Nanopore超長(zhǎng)reads（>100 kb）映射到初始組裝上，并使用PacBio HiFi和二代測(cè)序?qū)蚪M進(jìn)行拋光，填補(bǔ)了剩余的四個(gè)gap。最終基因組大小總計(jì)2086.89 Mb，所有染色體均為單一contig組成，沒(méi)有g(shù)ap。最終的基因組大小與基于流式和K-mer評(píng)估得到的約2 Gb基因組大小相當(dāng)。
為確定基因組中的著絲粒，作者利用TRASH進(jìn)行了K-mer分析，鑒定到每條染色體上有一個(gè)139個(gè)bp的重復(fù)區(qū)域（Fig 2C），可能是田菁中典型的著絲粒重復(fù)序列。Hi-C接觸圖顯示出沿著每個(gè)染色體對(duì)角線(xiàn)的良好組織的相互作用接觸模式（支持信息中的圖S4A）。Hi-C接觸矩陣的一些區(qū)域是空的，缺乏映射的Hi-C讀取（支持信息中的圖S4B和C）。這些白色區(qū)域與每個(gè)染色體中心的139個(gè)堿基單體重復(fù)的巨大衛(wèi)星陣列的位置重合。這些結(jié)果表明139個(gè)堿基單體重復(fù)可能是每個(gè)染色體的著絲點(diǎn)單體。作者對(duì)端粒重復(fù)（CCCTAAA/TTTAGGG）的分析發(fā)現(xiàn)已經(jīng)成功地在組裝中鑒定了所有24個(gè)端粒（Fig 2C）。在染色體2A、2B、3A、4B、5A和5B上還鑒定出了六個(gè)rDNA簇。作者進(jìn)一步使用BUSCO和QV評(píng)估了組裝的完整性和質(zhì)量，凸顯了該參考基因組具有較高的連續(xù)性和完整性，可被視為T(mén)2T基因組。
Fig S4
Hi-C互作圖譜顯示出沿著每個(gè)染色體對(duì)角線(xiàn)的良好的互作模式（Fig S4A）。Hi-C互作圖的一些區(qū)域是空的，缺乏映射的Hi-C reads（Fig S4B-C）。這些白色區(qū)域與每個(gè)染色體中心的139bp的單體重復(fù)位置重合。這些結(jié)果表明139個(gè)bp的單體重復(fù)可能是每條染色體的著絲粒。在作者組裝的參考基因組中，對(duì)端粒重復(fù)序列（CCCTAAA/TTTAGGG）的分析支持了作者鑒定到了所有的24個(gè)端粒（Fig S4D, Fig 2C）。作者進(jìn)一步使用BUSCO和QV兩個(gè)指標(biāo)評(píng)估了組裝的完整性和質(zhì)量 (Fig S4E），表明該組裝具有較高的連續(xù)性和完整性，可被視為T(mén)2T基因組。
此外，作者共注釋了89970個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，其中83065個(gè)（92.33%）在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中具有功能注釋。基因組受到轉(zhuǎn)座子的廣泛影響，占據(jù)了1.52 Gb（占基因組的72.94%）。最主要的轉(zhuǎn)座子是LTR-RTs，占據(jù)了基因組序列的52.82%。最豐富的兩個(gè)LTR亞家族分別是Copia（420.31 MB，占20.14%）和Gypsy（632.77 MB，占30.32%），兩者合計(jì)占據(jù)了所有LTR的95.53%。
結(jié)論3?亞基因組分選和異源多倍化
Fig 2D-E
S. cannabina是一種異源多倍體豆科植物，擁有兩套染色體。作者對(duì)10個(gè)二倍體（包括5個(gè)S. bispinosa和5個(gè)S. rostrata）以及Sesbania屬中的5個(gè)四倍體物種的基因組SNP做了系統(tǒng)發(fā)育分析，主成分分析和K-mer分析顯示這12條染色體可以分為兩組，分別命名為A亞基因組（Chr. 1A到Chr. 6A）和B亞基因組（Chr. 1B到Chr. 6B）（Fig 2D）。
作者進(jìn)一步利用進(jìn)化距離最近的Lotus japonicus計(jì)算了這兩個(gè)亞基因組的演化距離和同義替換率（Fig 2E），發(fā)現(xiàn)B亞基因組所有染色體中的單拷貝同源基因與Lotus japonicus的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系比A亞基因組的基因更為密切。這些結(jié)果不僅與亞基因組分類(lèi)一致，還表明B亞基因組可能比A亞基因組更古老。
Fig 2F
共線(xiàn)性分析表明，盡管S. cannabina與Lotus japonicus具有相同的偽染色體數(shù)目，但是所有染色體在它們分化后都經(jīng)歷了染色體斷裂和重組（Fig 2F），這些變化可能影響了S. cannabina的演化和適應(yīng)性。
Fig 3A-B
作者對(duì)12種豆科植物以及外類(lèi)群Mimosa pudica、Oryza sativa 和 Arabidopsis thaliana 構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)S. cannabina 與L. japonicus 關(guān)系最為密切，在約3,980 萬(wàn)年前發(fā)生分化（Fig 3A）。S. cannabina 的亞基因組約在約7.9 百萬(wàn)年前分離。通過(guò)Ks分析，作者發(fā)現(xiàn) S. cannabina的A 亞基因組和 B 亞基因組之間存在兩個(gè)顯著峰值（Fig 3B）。這兩個(gè)峰值對(duì)應(yīng)于物種分化事件和祖先豆科植物的全基因組復(fù)制事件。這些結(jié)果表明，S. cannabina 經(jīng)歷了一次祖先的全基因組復(fù)制，而不是最近的WGD。
結(jié)論4?LTR驅(qū)動(dòng)亞基因組進(jìn)化
Fig 3C
作者對(duì) S. cannabina 的兩個(gè)亞基因組以及其他測(cè)序的豆科植物基因組中TE含量進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)LTR-RTs的類(lèi)型和數(shù)量變化非常大（Fig 3C），導(dǎo)致基因組大小從Aeschynomene evenia的303 Mb到Pisum sativum的3,235 Mb不等。在已測(cè)序的豆科植物基因組中，S. cannabina、Arachis 和 Pisum 包含最多的LTR-RTs（Fig 3C）。相比之下，S. cannabina 的兩個(gè)亞基因組顯示出Gypsy和Copia逆轉(zhuǎn)錄元件的幾乎等量擴(kuò)增。
Fig 3D-E
作者通過(guò)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)將來(lái)自 S. cannabina 的總共23,227個(gè)完整的Gypsy和Copia超家族LTRs分為340個(gè)家族（Fig 3D）。Gypsy超家族分為五個(gè)主要類(lèi)群（CRM、Athila、Retand、Ogre和Tekay），而Copia超家族分為八個(gè)主要類(lèi)群。其中，對(duì)于Copia和Gypsy超家族，SIRE和CRM是主導(dǎo)的類(lèi)群。作者還發(fā)現(xiàn)A亞基因組和B亞基因組共享大多數(shù)類(lèi)群成員，但SIRE和Tekay的拷貝數(shù)量在兩個(gè)亞基因組之間不平衡，A亞基因組中這些TE的數(shù)量明顯更多（Fig 3E）。
Fig 3F-H
作者對(duì)S. cannabina鑒定到267.93 Mb的結(jié)構(gòu)變異，其中包括238.46 Mb的倒位、10.35 Mb的易位和19.12 Mb的復(fù)制。主要的七次大規(guī)模倒位事件（>10 Mb）發(fā)生在染色體1、2、3、5和6上。對(duì)兩個(gè)亞基因組的每個(gè)同源染色體進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，除了染色體5A和5B之間近60 Mb的長(zhǎng)度差異外，大多數(shù)染色體對(duì)在長(zhǎng)度上相似（Fig 3F）。幾乎所有同源染色體在TE或基因含量上都沒(méi)有顯著差異，但TE比例在染色體5A中顯著高于5B（Fig 3G），這表明染色體長(zhǎng)度差異是由TE的擴(kuò)張導(dǎo)致的。
染色體5A和5B之間的共線(xiàn)性分析表明在Chr5 末端存在約50 Mb的倒位，并在著絲粒附近存在明顯差異（Fig 3H）。在染色體5A的60–125 Mb區(qū)域檢測(cè)到幾個(gè)TE峰，包括LTR型和非LTR型TE。相比之下，在染色體5B的中心區(qū)域（57–59 Mb）僅檢測(cè)到一個(gè)峰。這些結(jié)果表明TE在染色體5A的擴(kuò)張中發(fā)揮了重要作用，并最終促使了兩個(gè)亞基因組的分化。在其他已測(cè)序的豆科植物基因組中，TE含量與基因組大小之間的相關(guān)性分析顯示出顯著的正相關(guān)性。這表明TE在豆科植物基因組的擴(kuò)張中是普遍存在的，并可能對(duì)它們的分化產(chǎn)生影響。
結(jié)論5?S. cannabina對(duì)堿性條件的耐受機(jī)制
Fig 4A-G
為了探索S. cannabina對(duì)堿性條件的耐受性，作者對(duì)在堿性土壤（pH約9.7）和黑色土壤（pH約7.2）中生長(zhǎng)的植物的根組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。作者從黑色和堿性土壤的根組織中鑒定了3,684個(gè)差異表達(dá)基因（上調(diào)1547，下調(diào)2137）（Fig 4A）。在亞基因組水平上，差異表達(dá)基因沒(méi)有明顯的偏倚。
作者對(duì)S. cannabina和M. sativa（苜蓿）的比較分析發(fā)現(xiàn)了17,097個(gè)共同的基因家族，以及10,457個(gè)僅屬于S. cannabina的基因家族。在這17,097個(gè)共同的基因家族中，有1,317個(gè)在S. cannabina中獨(dú)特誘導(dǎo)，而僅有94個(gè)基因家族在兩個(gè)物種中都顯示誘導(dǎo)。這些發(fā)現(xiàn)表明大麻和苜蓿之間存在著不同的堿性耐受機(jī)制。
作者對(duì)來(lái)自高梁（Sorghum bicolor）的堿堿性抗性基因AT1的分析揭示了與其在S. cannabina中的同源基因存在明顯的序列差異，表明這兩個(gè)物種之間存在不同的堿性耐受機(jī)制。此外，作者觀(guān)察到超氧化物歧化酶家族在堿性土壤脅迫下表達(dá)發(fā)生了顯著變化，表明它們?cè)谑艿綁A性脅迫時(shí)調(diào)節(jié)過(guò)氧化氫水平的作用。S. cannabina根組織中上調(diào)的DEGs的GO富集顯示，與磷酸鹽離子相關(guān)的生物過(guò)程相關(guān)（Fig 4B）。這一結(jié)果與堿性土壤中可用磷酸鹽濃度極低但總磷酸鹽濃度不低的事實(shí)一致（Fig 4C–F）。
在擬南芥中，磷的吸收依賴(lài)于磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（PHTs），這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在磷的獲取和穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用。因此，作者研究了S. cannabina、二倍體M. truncatula和A. thaliana中的PHTs。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，S. cannabina中的20個(gè)PHT基因?qū)儆谒膫€(gè)分支（Fig 4G）。值得注意的是，其中八個(gè)PHT基因（分別位于A(yíng)和B亞基因組中的四個(gè)基因）屬于A. thaliana和M. truncatula的PHT1;1,3,5 分支，位于染色體5A和5B上，并發(fā)生了基因復(fù)制。
Fig 4H-K
作者分析了S. cannabina中所有PHT1家族成員的表達(dá)量，其中四個(gè)PHT1基因（SC.4BG004299、SC.4BG004301、SC.4AG004483和SC.4AG004478）在根中高表達(dá)，并在堿性條件下被特異性誘導(dǎo)（Fig 4H-I）。通過(guò)細(xì)胞定位證實(shí)了S. cannabina 特有的 PHT（SC.4AG004478）專(zhuān)門(mén)位于根緣細(xì)胞中。為了測(cè)試這些蛋白質(zhì)是否能夠直接跨膜運(yùn)輸磷，作者在酵母突變株（YP100）中表達(dá)了兩個(gè)來(lái)自S. cannabina的PHTs（SC.4AG004483和SC.4BG004301）。該酵母株在不添加半乳糖的情況下無(wú)法生長(zhǎng)，因?yàn)樗狈α椎倪\(yùn)輸功能。作者的結(jié)果證實(shí)了這兩個(gè)PHTs的磷運(yùn)輸活性。為了研究這些特異性堿性誘導(dǎo)的PHT1基因是否具有共同的調(diào)控機(jī)制，作者使用每個(gè)基因起始密碼子上游2kb序列進(jìn)行了兩兩和局部的比對(duì)。點(diǎn)狀圖分析顯示，雖然上游序列存在顯著的序列變異，但在三個(gè)堿性誘導(dǎo)的PHT1基因（SC.4BG004299、SC.4BG004301、SC.4AG004478）的上游存在一個(gè)約為135bp的保守區(qū)域（Fig 4J）。有趣的是，在任何其他PHT1基因的上游2kb區(qū)域中，都沒(méi)有類(lèi)似的發(fā)現(xiàn)（Fig 4K）。
作者在保守區(qū)域鑒定到了一個(gè)應(yīng)激響應(yīng)motif（STRE）。先前的研究表明，通過(guò)STRE介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活導(dǎo)致對(duì)各種應(yīng)激條件的耐受性。因此，作者認(rèn)為在S. cannabina中，這些堿性誘導(dǎo)的PHT1基因可能受STRE的調(diào)控，以在堿性脅迫條件下增強(qiáng)磷酸鹽離子的吸收。
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