A cis-regulatory atlas in maize at single-cell resolution

關鍵詞：chromatin；single-cell；epigenomics；maize；gene regulation；ATAC-seq；plant development；pseudotime；transcription factor；cis-regulatory elements
原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867421004931

背景：

1. 什么是順式作用元件(cis-regulatory elements, CREs)：
   一段與結構基因串聯的非編碼DNA序列，一般位于轉錄點上游，作用是調節鄰近基因的轉錄。CREs是遺傳調控網絡的重要組成部分，進而控制形態發生、解剖學的發展以及胚胎發育的其他方面。
2. CREs、TF與染色質可及性之間的關系：
   (1) CRE 活性受核小體占有率的影響；大多數 TF 需要核小體耗盡的可接近染色質來結合其靶序列;
   (2) 轉錄結果由核心啟動子與特定 TF 在 CREs上 組裝的二級蛋白之間的相互作用決定;
   (3) 不同的 TF 表達和染色質可及性模式建立了細胞類型特異性的基因表達調控模式。
   因此，不同細胞類型中 CREs 和 TF 的詳細圖譜對于了解細胞功能和個體發育具有重要價值。
3. 植物學領域TF和CREs研究的局限性：
   (1) 細胞壁施加的技術限制
   (2)無法培養細胞系
   植物中單個細胞的表觀組學分析僅局限于擬南芥根部的研究。(Dorrity et al., 2020; Farmer et al., 2020).
4. CREs的遺傳變異可能是新表型產生的主要來源，能夠為現在育種提供重要參考。

在這篇文章中，作者通過scATAC-seq分析，繪制了遺傳模型和作物物種玉米的單細胞分辨率的Cis調節圖譜，分析了6個玉米組織中92種單細胞染色質可及性模式，揭示了協調染色質相互作用的 TF和非細胞自主活性TF，并比較了玉米與擬南芥發育過程中順式調控動力學的演變。

主要結果

一、 玉米中Cis調控圖譜的組裝
作者使用包括腋芽、雄蕊、雌花序、幼苗、胚根尖和胚后冠根在內的6個主要器官，進行流式分選單細胞，提取細胞核之后進行scATAC-seq生成了單細胞染色質可及性圖譜。總共包括56575個細胞核，31660個Tn5整合位點，產生了165913個ACR(accessible chromatin regions)。通過與Bulk ATAC-seq數據比較、轉錄起始位點富集、片段大小分布和基因分型混合，反映了高質量的scATAC-seq數據。因為大多數 scATAC-seq 分析工具都是針對人類和小鼠基因組量身定制的，所以作者開發了一種靈活的、基于物種未知模型的方法，利用準二項式邏輯回歸框架將不需要的技術變異來源刪除的R 包，Socrates 。

圖 1. 分析玉米中的單核染色質可及性

二、 細胞類型注釋和原位雜交
為了識別和注釋每個簇代表的細胞類型，作者進行了廣泛的文獻調研，手動確定了221個標記基因，同時也評估了Clusters之間的差異染色質可及性。已知markergene與背景基因組相比具有顯著的細胞類型特異性，圖1 E展示了6種不同細胞類型相關的Marker gene的細胞類型特異性的染色質可及性。 圖1 F中展示了花原基、木質部前體、L1表皮細胞中已知標記基因周圍的簇特異性染色質可及性。
為了證實預測的細胞類型注釋，我們對一部分差異可及的基因進行了 RNA原位雜交，沒有細胞類型特異性的先前證據。在所有情況下（五分之五），原位表達模式與基于基因可及性的預測定位相匹配。

三、單核染色質可及性和基因表達的整合
為了評估核轉錄和染色質可及性之間的關系，作者對15515個玉米幼苗核的進行了scRNA-seq并與scATAC-seq幼苗數據進行整合。 scATAC-seq (n = 11,882) 和 snRNA-seq (n = 15,515) 揭示了 19 個具有相似全基因組圖譜的簇（圖 2 B 和 2C）。基因變異性的比較突出了染色質可及性和跨簇核轉錄的一致模式，例如具有公認細胞類型特異性的標記基因(圖 2D, E)。這些分析表明，染色質可及性相對于RNA表達的變化更大，說明染色質結構能為剖析細胞類型異質性提供額外的信息(圖2 G)。
盡管基因可訪問性和表達之間存在關聯，但作者觀察到一部分可訪問基因缺乏轉錄證據（圖2H）,而無可及性基因幾乎完全與DNA甲基化相關。而另外對于染色質可及/沉默基因中ACR的基序分析，富集到了CNN重復序列，CNN重復基序與BPC1基因識別的序列之間存在顯著的重疊，在擬南芥中，BPC1轉錄因子家族與使用PREs（多梳響應元件）和甲基化進行基因沉默相關。表明某些PRC（多梳抑制復合物）的基因沉默活動需要具有可及性的PREs（響應元件）。

圖 2. 基因可及性反映單核分辨率下的 RNA 表達

四、CRE的基因組特征
為了探索定義細胞身份的 CRE，我們對具有跨細胞類型的染色質可及性的離散模式的 ACR 進行了分類，確定了總共 52,520 個 ACR（31%）。首先通過分析ACR兩側 2-kb 區域的相對DNA甲基化水平(圖 3A)，發現ACR 相對于周圍區域顯著低甲基化。通過自轉錄活性調節區測序發現，相對于對照和非特異性 ACR，簇特異性 ACR 與顯著更強的增強子活性相關(圖 3B)。 ACR與基因距離的分布圖顯示(圖 3C)，大量的ACR位于基因遠端，并且遠端ACR與LTR（長末端重復）反轉錄轉座子存在大量重疊。同時與不可及的LTR相比，與ACR一致的LTR展示出了顯著降低的DNA甲基化水平和更早的插入時間，并且也具有更高的細胞類型特異性(圖 D,E,F)。因此提示我們，LTR在玉米調控景觀中發揮了重要的進化作用。

為了查詢表型變異和細胞類型特異性之間的關系，我們量化了 ACR 中現存的遺傳變異。與非特異性 ACR 相比，細胞類型特異性 ACR 的多態性密度較低（圖 3 G），然而，嵌入在細胞類型特異性 ACR 中的遺傳變異更常與全基因組關聯研究確定的表型變異相關（圖 3 H），因此，細胞類型特異性 CRE 的遺傳擾動可能占表型變異的很大一部分。

圖3. ACR的表征

五、TF活性的變化定義了不同的細胞身份

為了建立不同細胞的 TF 特征，我們鑒定了玉米基因組中的 TF 基序。相對于對照（n = 165,913）和側翼區域（圖4A），ACR 富含 TF 基序。TF 基序在 ACR 峰內被強烈耗盡，與 TF 結合序列阻斷 Tn5 整合一致（圖 4A ）。為了定義每種細胞類型的 TF組合，我們評估了每種細胞類型的前 2,000 個差異 ACR 中 TF 基序的相對富集。每種細胞類型富集了約 43 個 TF 基序組合。我們假設 TF 基序和同源 TF 基因的染色質可及性狀態可用于闡明控制細胞狀態的調控規則。將 TF 基因可及性與其序列特異性結合位點的全局富集進行比較，揭示了跨細胞類型和單個細胞核的驚人相似的模式，反映了假定活性 TF 的多樣化組合景觀。對富集 TF 及其同源基序的評估確定了已知的細胞特性調節因子，包括根表皮祖細胞和毛細胞中的WRKY家族 TF、實質葉肉中的G2 - like1和AGAMOUS -like和花原基中的SEPALLATA TFs ，以及以前未被認識到的細胞類型調節劑作用的 TFs。

圖 4.TF基因和基序的組合可及性定義了細胞身份

六、可共同訪問的ACR反映了體內染色質的相互作用
scATAC-seq另一個重要應用是可以用來預測染色質結構。作者利用scATAC-seq數據計算了380萬個鄰近ACRs的可及性相關模式，即共可及性ACRs(與基因共表達相類似的概念)，例如圖A中展示了tb1基因附近在不同細胞類型中存在的共可及性ACRs。為了評估共可及性ACRs和體內相互作用的一致性，作者將幼苗時期的共可及性ACRs與同時期Hi-C數據進行了比較，發現在包括種子，穗等組織中，共可及性ACR附近有著很強的Hi-C信號，說明共可及性ACR可以用來很好的代表染色質環。
此外作者假設與H3K4me3和H3K27me3-HiChip染色質環一致的共可及性ACR可能與不同的轉錄結果相關。因此，他們比較分析了與這兩種染色質環相關的基因之間的RNA表達水平，發現盡管ACR的覆蓋率相似，但與H3K27me3共可及性ACR相關基因的表達表達顯著降低，這與兩側為H3K27me3的基因遠端的CRE的沉默功能一致(CRE通常為沉默子)。

圖 5. 可共同訪問的ACR反映了體內染色質的相互作用

七、動態染色質可及性是發育軌跡的基礎
在這部分中，作者著重分析與發育軌跡調控相關的動態染色質可及性變化。玉米頂端區域包圍著一組未分化的分生細胞，這些細胞到分化細胞是一個連續的發育過程。首先他們沿著偽時間軌跡的對18個發育連續體進行了排序，然后再分析每個偽時間軌跡上顯著變化的ACR、TF基因座和TF基序。圖B中以根韌皮部伴隨細胞 (PCC) 的發育軌跡，展示了他們的分析過程。他們鑒定了與PCC發育相關的440個TF基序，402個TF位點和8004個ACR，其中包括了幾個已知的分生組織和韌皮部發育相關基因，例如ARID8,ZmSMXL3,SUT1等等。

圖6. 染色質可及性在偽時間中是動態的

八、根系發育的進化
為了探索根發育過程中的調控保守程度，我們分析了來自 7 天的擬南芥根組織的 4,655 個細胞核的染色質可及性，將單核染色質圖譜與已發表的擬南芥根單細胞 RNA-seq整合在一起。并構建了 8 條順式調節偽時間發育軌跡。為了進行比較分析，他們對擬南芥的PCC進行了類似于玉米的分析，例如圖B中展示的與PCC發育相關的440個TF基序，265TF位點和3989個ACR，圖D,E展示幾個Marker基因表達和染色質可及性情況，驗證了數據分析的可靠性。
通過對比玉米和擬南芥的PCC發育過程，作者發現在這兩個物種中，10,976 個推定的直系同源基因中只有 206 個與 PCC 假時間相關（FDR < 0.01），表明大多數 PCC 軌跡相關基因是譜系特異性的。通過動態時間扭曲算法來對齊這206個與PCC發育軌跡相關的直系同源基因后，進行聚類分析發現，約50%（102/206）在偽時間中表現出相似的可及性變化模式，而剩余的直系同源基因則分別在兩個物種中發生了不同程度的偏移（圖F,G）。圖H中分別展示了保守的直系同源基因，在玉米中提前開放的基因以及在擬南芥中提前開放的基因，這些結果反映了玉米和擬南芥的PCC發育過程中調控功能的進化和新穎性。

圖7. 擬南芥和玉米PCC發育過程中的順式調控動力學

討論

1. 文章通過對6個玉米器官的92種單細胞染色質可及性模式分析，繪制了順式作用元件（CRE）編碼時空基因表達程序的基因組藍圖。
2. 通過分析TF組合和TF活性和結合，揭示了大量與細胞身份建立相關的順式和反式調節因子。
3. 發現細胞類型特異性 CRE 在增強子活性和未甲基化的長末端重復反轉錄轉座子內富集，還是表型相關遺傳變異的熱點，并且在現代玉米育種中被選擇，突出了CRE圖譜的生物學意義。
4. 此外，還通過比較玉米和擬南芥的發育軌跡，確定了具有保守和發散染色質動力學的TF和CRE，展示了基因調控網絡的廣泛進化。
5. 除了這個豐富的數據集，作者還開發了單細胞分析軟件Socrates，可用于了解任何物種的順式調節變異。