別人的筆記http://mooc.guokr.com/note/19064/
Lecture 1: Transcription and Assays
Segment 1: Introduction to Transcription
研究轉錄需要搞清：RNA聚合酶如何識別基因（特異性）和一個基因該以什么頻率進行轉錄（效率）。
第一部分分子生物學原理內容回顧
A promoter is the site that directs RNA polymerase to bind a gene. The transcription start site is usually at the downstream end of a promoter. A transcript encodes a protein, which requires that the translation start and termination sites must be within the area defined by the transcription start and termination sites.
Segment 2: Requirements for Transcription
雙鏈ＤＮＡ模板。模板鏈指導ｒＮＴＰ 的合成，非模板鏈不指導。
Segment 3: Assaying Transcription - Incorporation Assay
分析轉錄本。使用標記過的ｒＮＴＰ摻入以分析，所以叫Incorporation。其中有兩個問題：
１. 把ＲＮＡ產物從標記的ｒＮＴＰ中分離出來：濾紙結合分析法（不能提示長度信息也不能確切定位轉錄起始位點）和凝膠電泳（根據產物的大小，如果是幾百核苷酸的 可以用瓊脂糖膠；或如果產物更小，可以是丙烯酰胺凝膠；通過加入尿素防止ＲＮＡ的折疊）
２. 雖然起始點精確，但終止點不精確：為解決這一問題就可以在體外做 transcription runoff assay，失控轉錄分析，就是有一個限制酶切位點使得聚合酶在模板末端脫落，從而使得終止點相同。
Segment 4: Transcription Start Sites - Primer Extension引物延伸 1
測定轉錄起始位點的第一種方法：引物延伸實驗。
- 抽提RNA
- DNA探針。要有熒光標記 可以標記dNTPs or the DNA primer、DNA primer引物需要20-25個核苷酸的長度。
- 雜交
- 延伸引物，使用逆轉錄酶。當它延伸到轉錄起始點的時候會脫落。使用逆轉錄酶最好采用RT isolated from a virus infecting thermophilic bacteria and reverse transcribed at 60°C，因為高溫會移除RNA中可能的二級結構，是的逆轉錄酶在RNA的末端終止。
- 使用丙烯酰胺凝膠分離
TSS就是要測定的轉錄起始位點 transcription start site
Segment 5: Transcription Start Sites - Primer Extension 2
一個例子。TSS（Transcription Start Sites）永遠位于Translation Start Sites(也稱為start codon)的上游（即5‘端）。引物為61-81之間的長度，引物增長后再TSS位置處斷裂，發現是192個長度。
------------------------111 bases from TSS to Start Codon
----------------------------------------- 192bases
0 61---------81 DNA PRIMER
5‘----------------------------------------------------------------- RNA 3
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TSS Start Position of
Codon the Primer
Segment 6: Gene By Gene Expression - Reverse Transcriptase-PCR
檢測單基因表達量最常用的方法。在逆轉錄反應中引入PCR
Segment 7: Gene By Gene Expression - Real Time-PCR
用一種能與產物雙鏈DNA結合的染料，你就能看到染料越來越濃，顏色變深體現了產物生成過程。但是需要設置對照組，比如看管家基因actin的表達量，以排除掉污染。
Segment 8: Global Transcription - The Process of RNA-Seq
前面的方法只能研究一個基因，下面介紹全測序的方法，RNA-Seq
cDNA: copy DNA(complementory DNA)。由mRNA逆轉錄而來，接下來進行擴增、剪切、測序。
Segment 9: Global Transcription - The Data of RNA-Seq
Segment 10: Global Transcription - GRO-Seq 1
Global run on seq
GRO-seq是觀察單個基因轉錄速率最直接的方法
Segment 11: Global Transcription - GRO-Seq 2
優點是會獲得正在進行的轉錄信息
Lecture 2: Mechanism of Bacterial Transcription
Segment 1: The Structure of 細菌的RNA Polymerase聚合酶
Segment 2: The Activity of RNAP（RNA聚合酶的核心部分） and RNAP(holo)
RNAP需要一條DNA和一個缺口才工作、非特異的。
而RNA聚合酶的第五個亞基決定了特異性。叫做σ因子，可以識別啟動子序列。σ因子+RNAP=全酶RNAP(holo)。
RNAP(holo)可以從啟動子開始轉錄而RNAP不能。
Segment 3: Anatomy 解剖of a Bacterial Promoter啟動子
RNA通過啟動子的功能部件貼到DNA上
Segment 4: Mapping Bacterial Promoters
The promoter mapping strategy follows the same principal as the replicator mapping strategy you learned in 7.28.1x. Because the promoter will be adjacent to the transcription start site, the first step is to map the transcription start site, which one could do using a primer extension assay. Next you mutagenize suspected regions of importance and then assay the mutants for function. Loss-of-function indicates an integral part of the promoter. Crosslinking sigma to DNA would be a step of a ChIP protocol.
檢測突變的實驗：promoter fusion assay。把啟動子融合到一個產物蛋白質很容易被檢測的基因上，比如GFP(發綠光）或者LacZ
