質譜流式細胞技術（mass cytometry，MC）就是將電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）應用到單個細胞的分析，原理是用純化的單元素同位素標記抗體，然后使用ICP-MS檢測該元素離子峰。該技術融合了流式細胞分選儀和ICP-MS。操作流程簡單，如圖1所示，首先細胞用帶有金屬元素（一般是鑭系金屬）的特異性抗體標記3-4，然后被送入質譜流式細胞儀，細胞以單個細胞液滴狀態被霧化后進入高溫等離子體，產生自由原子，四級桿選擇只通過鑭系金屬質量范圍內的離子，去除其余離子，利用飛行時間質譜（TOF mass spectrometry）檢測鑭系金屬離子的相對信號強度。質譜流式細胞儀由多倫多大學的研究人員首先研發出來，第一臺商品化的質譜流式細胞儀名為Cytometry by Time-Of-Flight (CyTOF)，相關抗體試劑由DVS Sciences公司生產和銷售。

傳統流式細胞術用熒光基團作為報告分子，通過對發射光強度定量以確定目標分子的表達量，但熒光基團發射譜常有重合，尤其是在同一個實驗中進行多參數測量的情況下，難以區分多個熒光基團。質譜流式細胞技術使用單一分子量的穩定鑭系金屬代替熒光基團作為報告分子，元素質譜分析儀能夠通過分子量準確區分不同原子質量，并且不同鑭系金屬質量沒有信號重疊，增加了定量的準確性。

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目前，質譜流式細胞技術可以同時對51個靶蛋白進行檢測，每秒檢測1000個細胞，平均每天可檢測100個樣品，最低檢測限為100個拷貝分子，已經過驗證的鑭系金屬標記抗體種類超過400種；除常規蛋白外，質譜流式細胞技術還可用于蛋白翻譯后修飾1，蛋白降解產物5，檢測細胞存活率，細胞大小，mRNA轉錄子表達量6，DNA合成速率7以及蛋白酶活性8等的測定。

多路質譜流式細胞技術

正如蛋白質組學中的非標記定量，質譜流式細胞技術對靶點的定量準確性也受到不同儀器離子化效率的差異、儀器狀態等的影響；同時，傳統的質譜流式細胞技術每次只能檢測一個樣品，通量較低。因此，質量標簽細胞條碼技術（mass-tag cellular barcoding，MCB）應運而生。

細胞經過藥物等處理后，用多聚甲醛固定后，使用MCB試劑對不同樣本的細胞進行條形碼標記，然后將不同樣本混合后進行常規質譜流式細胞分析前處理和檢測。最終通過檢測條形碼對應的元素離子，對細胞進行樣品歸類。

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圖2. 多路質譜流式細胞技術

多路質譜流式細胞技術實驗步驟如圖2所示，不同處理的樣本經過甲醛固定，使用不同mDOTA分子對不同樣本進行標記，然后進行常規的質譜流式細胞分析的前處理和檢測。

這里使用的mDOTA分子是一個雙功能化合物，一端可以螯合金屬離子，一端則可以和細胞中蛋白上的自由巰基以共價鍵形式結合（如圖3所示），一個mDOTA分子可以螯合一個鑭系金屬元素原子，那為什么叫barcode呢？ Barcode 就是指可以同時添加多種被鑭系金屬元素螯合的mDOTA分子，在CyTOF中共價鍵被打碎后，每種鑭系金屬元素的峰即可形成有和無兩種情況，使用的鑭系金屬元素螯合的mDOTA試劑的種類越多，最終可組成的條形碼種類越多，如圖4所示，使用7種鑭系金屬元素螯合mDOTA試劑，可以組成2的7次方種條形碼，即可以同時標記128個樣品。 MCB的使用，可以對多個樣本同時進行單細胞定量分析，增加了質譜流式細胞分析技術的分析通量，并且增加了相對定量的準確性。 本文一開始提到的那篇Cell Stem Cell的文章，就是利用MCB技術，在單細胞層面研究人源紅細胞生成過程中內源轉錄因子的表達和調控。

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圖3. mDOTA分子反應原理

細胞使用雙功能分子mDOTA（maleimido-mono-amide- DOTA）以共價鍵形式進行標記。mDOTA一端可以螯合稀土元素，一端可以和細胞內的蛋白的巰基反應。

但是MCB存在一定的缺陷，首先在每次儀器校正后，質譜流式細胞儀的離子檢測靈敏度都會發生變化，盡管可以用內參進行校正，將樣品混合后檢測會降低樣品之間的變化程度； 其次，MCB使用鑭系金屬元素和后期使用的抗體耦連的鑭系金屬不能相同，因此MCB的使用縮小了后續標記抗體的選擇范圍。 因此，后來基于鈀元素的MCB試劑被進一步發展出來11。 使用鈀元素的6個同位素原子進行MCB分子的構建有以下兩點優勢： 首先，鈀元素因為和標記抗體的試劑（Diethylene triamine pentaacetic acid (DTPA)-based polymer）不兼容，抗體標記不會使用鈀元素，因此MCB分子使用鈀元素不會干擾后續標記抗體的選擇； 第二，Pd有6個穩定同位素，102, 104, 105, 106, 108和110 amu, 純度很高，分別為91%, 96%, 98%, 99%, 99%和99%，這些同位素和其他鑭系金屬元素質量相差甚遠，不會影響后續的抗體耦連的鑭系金屬元素的檢測。

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圖4. MCB形成原理

使用七種鑭系金屬元素螯合mDOTA試劑，按圖中分布添加mDOTA試劑，可以組成2的7次方種條形碼，即可以同時標記128個樣品。

質譜流式細胞技術的優缺點

最后我們簡單說一下這個技術的優缺點。優點是可同時檢測的通道比較多，現在可以做到同時檢測51個目標蛋白；可操作性強，試劑都是商品化的；速度雖然比不上流式細胞儀（每秒10000個細胞），但也并不慢，每秒可檢測1000個細胞；成本低，平均每個細胞測量成本僅需0.005美分，對比單細胞測序技術每個細胞平均22美元，可以說是相當便宜了。

當然，就目前來看，這個技術還存在不少的不足之處。 首先，細胞在分析中被霧化并離子化，在分析后不能保留完整的活細胞狀態； 其次，靈敏度低于熒光基團，不能檢測極低水平表達的分子，檢測的動態范圍最多只能達到3-4倍，而熒光基團的檢測范圍則可到50倍左右；第三，不同儀器之間的離子化效率不同，需要通過摻入聚苯乙烯珠子進行信號強度的校正，實現同一個儀器的數據的比較； 第四，和基于熒光基團的流式細胞技術一樣，質譜流式細胞技術仍然不能檢測小分子代謝產物，并且不能對一個細胞進行連續的動態監測； 最后，也是最重要的一點，不能對蛋白組中的所有蛋白進行監測，只能對特定目標蛋白進行檢測，因此需要更為嚴謹的實驗設計。

不管怎樣，質譜流式細胞技術還在不斷地發展和改進，我們能利用這個技術解決的問題也越來越多。希望通過這次對質譜流式細胞技術的系統性介紹，也能為大家目前面臨的問題提供一點新思路，為大家的課題添磚加瓦。（來源清華大學蛋白質研究技術中心蛋白質化學與組學平臺）

參考文獻：

1. Bendall, S. C.; Nolan, G. P.; Roederer, M.; Chattopadhyay, P. K., A deep profiler's guide to cytometry. Trends Immunol 2012, 33 (7), 323-32.

2. Thomas, R., Practical Guide to ICP-MS: A Tutorial for Beginners, Second Edition. Pract Spectrosc 2008, 1-339.

3. Lou, X. D.; Zhang, G. H.; Herrera, I.; Kinach, R.; Ornatsky, O.; Baranov, V.; Nitz, M.; Winnik, M. A., Polymer-based elemental tags for sensitive Bioassays. Angew Chem Int Edit 2007, 46 (32), 6111-6114.

4. Majonis, D.; Herrera, I.; Ornatsky, O.; Schulze, M.; Lou, X. D.; Soleimani, M.; Nitz, M.; Winnik, M. A., Synthesis of a Functional Metal-Chelating Polymer and Steps toward Quantitative Mass Cytometry Bioassays. Anal Chem 2010, 82 (21), 8961-8969.

5. Bjornson, Z. B.; Nolan, G. P.; Fantl, W. J., Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states. Curr Opin Immunol 2013, 25 (4), 484-494.

6. Frei, A. P.; Bava, F. A.; Zunder, E. R.; Hsieh, E. W. Y.; Chen, S. Y.; Nolan, G. P.; Gherardini, P. F., Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nat Methods 2016, 13 (3), 269-+.

7. Behbehani, G. K.; Bendall, S. C.; Clutter, M. R.; Fantl, W. J.; Nolan, G. P., Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytom Part A 2012, 81a (7), 552-566.

8. Edgar, L. J.; Vellanki, R. N.; Halupa, A.; Hedley, D.; Wouters, B. G.; Nitz, M., Identification of Hypoxic Cells Using an Organotellurium Tag Compatible with Mass Cytometry. Angew Chem Int Edit 2014, 53 (43), 11473-11477.

9. Spitzer, M. H.; Nolan, G. P., Mass Cytometry: Single Cells, Many Features. Cell 2016, 165 (4), 780-791.

10. Bodenmiller, B.; Zunder, E. R.; Finck, R.; Chen, T. J.; Savig, E. S.; Bruggner, R. V.; Simonds, E. F.; Bendall, S. C.; Sachs, K.; Krutzik, P. O.; Nolan, G. P., Multiplexed mass cytometry profiling of cellular states perturbed by small-molecule regulators. Nat Biotechnol 2012, 30 (9), 858-U89.

11. Zunder, E. R.; Finck, R.; Behbehani, G. K.; Amir, E. D.; Krishnaswamy, S.; Gonzalez, V. D.; Lorang, C. G.; Bjornson, Z.; Spitzer, M. H.; Bodenmiller, B.; Fantl, W. J.; Pe'er, D.; Nolan, G. P., Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nat Protoc 2015, 10 (2), 316-333.