單細(xì)胞譜系追蹤揭示了TCF15在造血中的作用
發(fā)表期刊：Nature
發(fā)表日期：2020年7月
發(fā)表單位：哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院
文本目錄:
1. 一些之前不知道的基礎(chǔ)知識(shí)
2. Abstract
3. Introduction
關(guān)于LARRY慢病毒barcode文庫(kù)和inDrop scRNAseq
CRISPR screen
1.一些之前不知道的基礎(chǔ)知識(shí)：
1、Lentivirus慢病毒：Lenti-在拉丁文中有慢的意思；慢病毒感染患者早期很難觀察，大多都會(huì)經(jīng)歷一個(gè)長(zhǎng)達(dá)數(shù)年的潛伏期，之后會(huì)緩慢發(fā)病，因此這些病原微生物被稱之為慢病毒。
慢病毒載體：慢病毒載體是以HIV-1(人類免疫缺陷I型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的基因治療載體，該載體可以將外源基因有效地整合到宿主的染色體上，從而達(dá)到外源基因的持久性表達(dá)。
2、transduce轉(zhuǎn)導(dǎo)：DNA也可以以病毒或病原菌為載體被帶入宿主細(xì)胞；應(yīng)用這種病毒或病菌的轉(zhuǎn)染技術(shù)于細(xì)胞時(shí)，就是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行transduce
3、heterogeneity細(xì)胞異質(zhì)性：細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中，經(jīng)過(guò)多次分裂增殖，在完成其生命周期的同時(shí)也會(huì)呈現(xiàn)分子生物學(xué)或基因方面的改變，從而產(chǎn)生細(xì)胞（狀態(tài)的或類型的）多樣性，這些多樣性就叫做heterogeneity。
4、Cluster analysis/Clustering聚類分析：是把相似的對(duì)象通過(guò)靜態(tài)分類的方法分成不同的組別或者更多的子集（subset），這樣讓在同一個(gè)子集中的成員對(duì)象都有相似的一些屬性，常見(jiàn)的包括在坐標(biāo)系中更加短的空間距離等。
5、Louvain 算法：可探究出細(xì)胞異質(zhì)性的一種聚類分析算法。http://www.lxweimin.com/p/ea4140dc72a3
6、DNA barcoding是一種利用基因組內(nèi)的DNA片段來(lái)鑒定生物物種的技術(shù)。
動(dòng)物物種的鑒定采用線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基I基因(cytochrome c oxidase I, COI)作為通用DNA條形碼序列。
inDropscRNA-seq // Droplet-based single-cell RNA-seq我的另一篇文
7、quiescent cell 靜止細(xì)胞 在生理情況下，這類細(xì)胞增殖不明顯，在細(xì)胞增至周期中處于靜止（G0），但受到組織損傷的刺激時(shí)，則進(jìn)入DNA合成前期（G1），表現(xiàn)出較強(qiáng)的再生能力。
8、LARRY(lineage and RNA recovery) lentiviral barcoding library 我的另一篇文章
2.Abstract：
? ? ? 骨髓移植療法依賴于造血干細(xì)胞（HSC）的終生再生能力。HSC在克隆水平上呈現(xiàn)出多種多樣的再生行為，但這種多樣性的潛在機(jī)制仍然未定。單細(xì)胞測(cè)序的最新進(jìn)展揭示了HSC之間的轉(zhuǎn)錄差異，為他們功能異質(zhì)性提供了可能的解釋。但是，測(cè)序分析的破壞性造成不能同時(shí)觀察干細(xì)胞狀態(tài)和功能。
? ? ? 為了解決這個(gè)問(wèn)題，用可表達(dá)的慢病毒條形碼（lentiviral barcoding），能夠在長(zhǎng)期 同時(shí)分析 成年HSC的譜系和轉(zhuǎn)錄組 和 它們微觀重建過(guò)程中的克隆軌跡。分析 具有不同行為的克隆 之間的 差異基因表達(dá) 發(fā)現(xiàn)了 一個(gè)內(nèi)在的分子標(biāo)志物，該分子標(biāo)志物能夠表征functional long-term repopulating HSCs。通過(guò)體內(nèi)CRISPR篩選探索這一特征，研究人員發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子TCF15是必需的，并且其足以促進(jìn)HSC靜止和長(zhǎng)期自我更新。原位Tcf15表達(dá) 標(biāo)記了真正多能HSC的最原始細(xì)胞子集。總之，我們的工作闡明了與功能干細(xì)胞異質(zhì)性相關(guān)克隆的內(nèi)在分子機(jī)制，并確定HSC保持自我更新?tīng)顟B(tài)的機(jī)制。
3.Introduction:
? ? ? 為了同時(shí)分析多個(gè)干細(xì)胞克隆的mRNA和譜系信息，我們從8周小鼠中分離了長(zhǎng)期HSC(LT-HSCs)，并用lineage and RNA recovery (LARRY)lentiviral barcoding library對(duì)他們進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。我們將約1000個(gè)標(biāo)記細(xì)胞移植入8周齡致死照射的受體，并且 通過(guò)inDrop scRNA-seq 分析 在移植后16-24周遷移細(xì)胞穩(wěn)定狀態(tài) 的HSC和祖細(xì)胞【committed progenitor cell fractions】。我們使用Louvain clustering 來(lái)識(shí)別不同干細(xì)胞和祖細(xì)胞類群【progenitor populations】，并 在先前鑒定的標(biāo)志物的表達(dá)基礎(chǔ)上 進(jìn)行標(biāo)記和合并。然后，我們將 LARRY lentiviral barcodes 分配到每個(gè)細(xì)胞 去重建克隆關(guān)系。重要的是，我們以LARRY對(duì)long-term clonal tracking進(jìn)行基準(zhǔn)，證實(shí)了：文庫(kù)多樣性足以標(biāo)記單細(xì)胞，barcode calling 對(duì)大多數(shù)類群【populations】有效，單細(xì)胞讀數(shù)能準(zhǔn)確地代表 DNA barcodes，而barcode silencing 可忽略。
? ? ? 對(duì)HSC和progenitor barcodes的評(píng)估證實(shí)：造血功能主要由HSC維持，如前所述，大多數(shù)子代 存在【represent in】 至少一個(gè)barcoded HSC。這個(gè)實(shí)驗(yàn)框架允許我們分析227HSCs的功能性行為，以及他們相關(guān)的基因表達(dá)程序【programmes】。我們觀察到，很大程度上子代輸出活動(dòng)【progeny output activity (Ai)】方面 的克隆異質(zhì)性，這是由ratio定義的， the abundance豐度of agiven clone i in the committed progenitor pool /its frequency頻率 in the HSC compartment range: 0–51, mean = 1.66。引人注目的是，超過(guò)55%的 HSC clones (~60% of all HSCs)被歸類為 相對(duì)low-output，自我更新能力遠(yuǎn)超過(guò)差異化Ai < 1。重要的是，low-output克隆并不是樣品的假象，因?yàn)楦哌_(dá)588個(gè)細(xì)胞的克隆都顯示了這種行為。盡管先前的retroviral逆轉(zhuǎn)錄病毒 barcoding 研究表明存在低產(chǎn)量克隆，但我們的單細(xì)胞方法讓我們能夠準(zhǔn)確定量并且了解這種特性的程度。我們還發(fā)現(xiàn)，HSC clones的譜系偏差【lineage bias（Bi）】有很大程度上的不同，Bi是頻率比f(wàn)requency ratio，anysingle lineage/the other progenitors。特別是，我們發(fā)現(xiàn)約30%的克隆呈現(xiàn)出巨核細(xì)胞megakaryocyte (Mk) 偏向的輸出，并且占所有Mk子代的50-60%，與之前的觀察一致。
? ? ? 除了定義clonal HSC異質(zhì)性之外，我們的方法還使我們能夠同時(shí) 表征 功能不同的克隆之間 基因表達(dá)的差異。與high-output HSC相比，low-output HSC克隆表現(xiàn)出更高的靜態(tài)水平【quiescence】和 自我更新標(biāo)志物，如Txnip, Mllt3, Socs2, Mpl, Mycn, Cdkn1c and Ndn，除了HSCs中描述不足的一些其他成分，包括those encoding fatty-acid oxidation enzymes (Hacd4), MHC class II components (Cd74 and H2-Eb1) and transcription regulators (Nupr1 and Tcf15)。有趣的是，low-output HSC signture和Mk-biased HSC signature有多個(gè)相同基因。分析計(jì)算的signature scores ，證實(shí)了low-output基因和Mk-bias基因 共表達(dá)【co-expressed 】 并與高度純化的天然LT-HSCs的published signatures 重疊，而它們與細(xì)胞周期signature score呈負(fù)相關(guān)，表明HSC移植后相對(duì)靜止quiescent的狀態(tài)。HSC output activity (Ai) 和 Mk bias (Bi) 的barcode 測(cè)量結(jié)果也顯示出 顯著的負(fù)相關(guān)（r = ? 0.74），證實(shí)了low-output 和Mk-biased behaviours 在同一組克隆中 are enriched （P < 0.001）。重要的是，這些行為不限于 通過(guò)transcriptional clustering 方法定義的獨(dú)特的HSC subpopulations，也 強(qiáng)調(diào)了克隆追蹤【clonal tracking】與研究HSC異質(zhì)性的相關(guān)性。
? ? ? 總而言之，我們的數(shù)據(jù)表明，即使在移植后，大量植入的 HSCclones 仍顯示出較低的子代output （與clone size無(wú)關(guān)），對(duì)Mk譜系 biasedly，并表達(dá)出獨(dú)特的signature ，其中包含與靜止quiescence 和自我更新self-renewal相關(guān)的基因。我們認(rèn)為，移植后，a subset of HSCs 會(huì)重新獲得與未受干擾的天然LT-HSC相似的構(gòu)型【configuration】，這對(duì)在生命第一年過(guò)程中的成熟后代的影響也很小，并表明Mk譜系占主導(dǎo)地位。
關(guān)于LARRY慢病毒barcode文庫(kù)和inDrop scRNAseq
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CRISPR screen
利用功能缺失的策略進(jìn)行的高通量遺傳篩選，是研究人員快速尋找調(diào)控特定表型的重要或關(guān)鍵基因的主要方法。CRISPR基因篩選，可以通過(guò) CRISPR gRNAs 靶向不同細(xì)胞中成百上千各異的基因，然后通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選編輯細(xì)胞，gRNA 可以幫助確定哪些基因?qū)τ谏飳W(xué)作用機(jī)制具有至關(guān)重要的作用。然而，這種篩選方法比較適用于回答與細(xì)胞生長(zhǎng)能力直接相關(guān)的問(wèn)題。
如果我們想研究基因調(diào)控和其它復(fù)雜的生物控制機(jī)制，就要明白多個(gè)基因是如何協(xié)同工作還有調(diào)控調(diào)節(jié)細(xì)胞狀態(tài)。這就需要針對(duì)每個(gè)CRISPR靶向基因，分別進(jìn)行培養(yǎng)，編輯和分析細(xì)胞。
這時(shí)候可以采用CRISPR + inDrop scRNA-seq
CRISPR上文講過(guò)，他可以在特定位點(diǎn)敲除基因，進(jìn)而觀察細(xì)胞其他結(jié)果。
inDrop scDNA-seq，之前的一篇文章有講解。他可以同時(shí)（一次實(shí)驗(yàn)），測(cè)出幾千個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組水平。
當(dāng)這兩種技術(shù)靈魂大互換之后，誕生除了一種新的技術(shù)：CROP-seq（CRISPR droplet sequencing，CRISPR液滴測(cè)序）
