方法一：基于hmm模型的鑒定方法
1.準(zhǔn)備數(shù)據(jù)
①下載擬南芥基因組fasta文件、注釋文件gtf/gff3文件：ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-36/fasta/arabidopsis_thaliana/
Arabidopsis_thaliana.TAIR10.gff3.gz
Arabidopsis_thaliana.TAIR10.cds.all.fa.gz
Arabidopsis_thaliana.TAIR10.dna.toplevel.fa.gz
Arabidopsis_thaliana.TAIR10.pep.all.fa.gz
②下載 NBS-ARC基因家族的hmm模型：http://pfam.xfam.org/(下載方法參見 零基礎(chǔ)-完全重現(xiàn)某個(gè)基因家族分析文章（的分析部分）)
NBS-ARC.hmm #PF00931
2.目標(biāo)基因家族搜索與篩選
source /data1/spider/miniconda3/bin/activate
conda activate bioinforspace
#目標(biāo)基因家族搜索
hmmsearch --cut_tc --domtblout NBS-ABC.out NBS-ARC.hmm Arabidopsis_thaliana.TAIR10.pep.all.fa.gz
#過濾篩選得到E-value小于1*10-20,先拿到序列號
grep -v "#" NBS-ABC.out|awk '($7 + 0) < 1E-20'|cut -f1 -d " "|sort -u > NBS-ARC_qua_id.txt
#再根據(jù)序列號，從Arabidopsis_thaliana.TAIR10.pep.all.fa.gz中提取序列
less Arabidopsis_thaliana.TAIR10.pep.all.fa.gz | /data1/spider/ytbiosoft/seqkit grep -f NBS-ARC_qua_id.txt > NBS-ARC_qua.fa
3.多序列比對，構(gòu)建目標(biāo)物種的NB-ARC基因家族的hmm模型
#對篩選出來的序列用clustalw進(jìn)行多序列比對
/data/shaofeng/clustalw/clustalw
彈出clustalw的操作界面，以下展示具體輸入過程：
選擇1（輸入待比對序列）→ 輸入待比對序列的文件名：NBS-ARC_qua.fa → 選擇2（開始進(jìn)行序列比對）→選擇9（選擇輸出比對結(jié)構(gòu)的格式為aligned）→ 按enter鍵 → 選擇1（選擇比對模式為全局比對） → 指定輸出的比對結(jié)果的文件名稱:NBS-ARC_qua.aln → 回車后開始比對 → 輸入一個(gè)樹文件名(new GUIDE TREE file):NBS-ARC_qua.dnd （最后才能得到NBS-ARC.aln，否則NBS-ARC.aln為空）
#使用hmmbuild對這些置信的序列進(jìn)行隱馬爾可夫模型的構(gòu)建，即構(gòu)建更加準(zhǔn)確的hmm模型來盡可能的預(yù)測目標(biāo)物種中NBS-ARC基因家族中所有的成員。
hmmbuild NBS-ARC_qua.hmm NBS-ARC_qua.aln
hmmsearch --cut_tc --domtblout NBS-ARC.second.out NBS-ARC_qua.hmm Arabidopsis_thaliana.TAIR10.pep.all.fa
4.利用目標(biāo)物種的hmm模型再次篩選目標(biāo)物種中符合要求的序列
#再次對這些基因進(jìn)行過濾和提取
grep -v "#" NBS-ARC.second.out|awk '($7 + 0) < 1E-03' | cut -f1 -d " "|sort -u >final.NBS.list
less Arabidopsis_thaliana.TAIR10.pep.all.fa.gz | /data1/spider/ytbiosoft/seqkit grep -f final.NBS.list > final_NBS-ARC_qua.fa
方法二：基于同源比對blast的鑒定方法
1.下載NCBI 中所有植物存在于Ref-seq中的NBS序列（Ref-seq一般被認(rèn)為是比較置信的植物基因序列）
2.將下載的蛋白序列存放至ref.nbs.plant.fa文本文檔中，上傳至服務(wù)器
3.blastp比對并篩選目標(biāo)物種中符合要求的序列
#用makeblastdb建立blast數(shù)據(jù)庫
makeblastdb -in ref.nbs.plant.fa -dbtype prot -out blastdb
#用blastp進(jìn)行序列搜索，得到每個(gè)序列的相似序列
blastp -num_threads 20 -db blastdb -query Arabidopsis_thaliana.TAIR10.pep.all.fa -outfmt 7 -seg yes > blastp.out &
#篩選identity大于75%的序列
cat blastp.out |awk '$3>75' |cut -f1 |sort -u > blastp_result_id.list
將上述兩種方法得到gene id合并取交集，找出兩種方法共有的基因家族成員，使結(jié)果更可信。
comm -12 blastp_result_id.list final.NBS.list > common.list
less Arabidopsis_thaliana.TAIR10.pep.all.fa.gz | /data1/spider/ytbiosoft/seqkit grep -f common.list > final_searh_NBS-ARC_qua.fa
最后，還可以通過一些網(wǎng)上的保守結(jié)構(gòu)域搜索網(wǎng)頁，進(jìn)一步對所找出的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，比如：
NCBI CD-Search tool https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi
Pfam的搜索 https://pfam.xfam.org/search#tabview=tab1
InterProScan sequence search https://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search
參考：
01 基因家族專題(1)：基礎(chǔ)知識與研究思路介紹
02 基因家族專題(2)：數(shù)據(jù)下載與基因家族成員的鑒定
03 基因家族專題(3)：基因家族成員的鑒定
04 seqkit 使用說明- 知乎
