topGO手冊中的實例實現
手冊地址：http://bioconductor.uib.no/2.7/bioc/vignettes/topGO/inst/doc/topGO.pdf
快速入門部分可以參考：https://rpubs.com/aemoore62/TopGo_colMap_Func_Troubleshoot
1. 導入基因和注釋數據
用library(topGO)導入topGO包后，會自動創建三個環境，即GOBPTerm，GOCCterm和GOMFTerm，這些環境是有GO.db包中的GOTERM環境為基礎創建的，以方便載入GO
library(topGO)
BPterms <- ls(GOBPTerm)
head(BPterms)
## [1] "GO:0000001" "GO:0000002" "GO:0000003" "GO:0000011" "GO:0000012" "GO:0000017"
genefilter包
genefilter包用來過濾基因，第一個參數為矩陣或者ExpressionSet對象，第二個參數flist接受一系列函數（經過filterfun合并的），這些函數的參數必須以向量（對應矩陣的每一行）為對象，返回邏輯值，pOverA函數也是genefilter包內置的構造函數，p表示比例，A表示數值，表示必須要有p比例的值超過A
library(genefilter)
ff<- pOverA(p=.1, 10)
flist <- filterfun(ff)
set.seed(2018-4-24)
exprA <- matrix(rnorm(1000, 7), ncol = 10)
ans <- genefilter(exprA,
flist=filterfun(ff,
function(x) any(x<6)))
exprB <- exprA[ans,]
2. topGOdata對象
構建topGOdata對象的3個數據
- 基因某種ID的列表（可以有另一個對應的分數值，如p值或t統計量，或者是差異表達值）
- 基因的這種ID與GO的映射表，在ID為芯片的探針ID時，可以直接使用bioconductor的芯片注釋包如
hgu95av2.db包 - GO的層次關系數據，這個結果可以從GO.db包獲得，topGO也只支持GO.db包定義的層次結構
構建topGOdata對象的參數：
- ontology：字符串，代表所關注的ontology類別包括“BP”，“MF”或“CC”
- description：字符串，對該研究的簡介
- allGenes：帶名字的vector可以是數值或factor類型，vector的name屬性為基因的某種ID號，這些基因代表所有的基因總數
- geneSelectionFun：根據allGenes的數值選出顯著的目標基因的函數，如果allGenes是數值向量則該參數不可省略，如果是factor（0,1）的向量則不需要指定
- nodeSize：過濾掉一些低富集的GO term，根據nodeSize的值過濾
- annotationFun：注釋函數，把gene的某種ID號映射為GO terms的編號，其選項包括
- annFUN.db：表示從安裝的包如
hgu95av2.db中獲取對應的注釋- 若為annFUN.db，則還需加參數affyLib，值為芯片注釋包的名稱
- annFUN.db：表示從安裝的包如
- annFUN.org：表示從安裝的包如
org.XXX中獲取對應的注釋，目前該函數支持Entrez，Genebank，Alias，Ensembl，GeneSymbol，GeneName，UniGene的ID- 若為annFUN.org，則還需加參數如mapping="org.Hs.eg.db", ID="Ensembl"
- annFUN.gene2GO：當用戶提供gene-to-GOs的注釋數據時使用該函數
- 若為annFUN.gene2GO，則還需加參數gene2GO，值為讀入的list變量
- annFUN.GO2gene：當用戶提供GO-to-genes的注釋數據時使用該函數
- 若為annFUN.GO2gene，則還需加參數GO2gene，值為讀入的list變量
- annFUN.file：表示從文件讀取注釋數據如gene2GO文本文件或GO2genes文本文件
- 若為annFUN.file，則還需加file參數，值為相應的ID和GO號（多個GO以逗號隔開）的文本文件路徑
2.1 構建注釋（可以自定義選擇某種證據強度的注釋）
2.1.1 從NCBI下載go annotation，并處理為topGO可識別的list數據
下載壓縮包并解壓：https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/gene/DATA/gene2go.gz
該文件包含所有物種的entrzID和GO的對應關系，人的物種編號為“9606”
library(data.table)
geneID2go <- fread('grep "^9606\t" NCBI_data/gene2go')
colnames(geneID2go) <- unlist(read.delim("NCBI_data/gene2go",
header=F, nrow=1,
stringsAsFactors=F))
geneID2go_list <- by(geneID2go$GO_ID, geneID2go$GeneID,
function(x) as.character(x))
head(geneID2go_list)
## $`1`
## [1] "GO:0002576" "GO:0003674" "GO:0005576" "GO:0005576" "GO:0005615"
## [6] "GO:0008150" "GO:0031012" "GO:0031093" "GO:0034774" "GO:0043312"
## [11] "GO:0070062" "GO:0072562" "GO:1904813"
library(topGO)
goID2gene_list <- inverseList(geneID2go_list)
2.1.2 從geneontology官網下載go annotation
下載并解壓：http://geneontology.org/gene-associations/goa_human.gaf.gz
library(data.table)
geneSymbol2go <- fread(
'awk \'{print $3 "," $4}\' gene_ontology_data/goa_human.gaf | grep "GO:"',
header=FALSE, sep=",")
geneSymbol2go_list <- by(geneSymbol2go$V2, geneSymbol2go$V1,
function(x) as.character(x))
head(geneSymbol2go_list)
## $A0A075B6Q4
## [1] "GO:0000056" "GO:0005634" "GO:0030688" "GO:0031902" "GO:0034448" "GO:0042274"
library(topGO)
goSymbol2gene_list <- inverseList(geneSymbol2go_list)
2.1.3 使用實例數據與readMappings函數
readMappings函數是topGO包中的函數，讀入文件格式為
068724 GO:0005488, GO:0003774, GO:0001539, GO:0006935, GO:0009288
119608 GO:0005634, GO:0030528, GO:0006355, GO:0045449, GO:0003677, GO:0007275
133103 GO:0015031, GO:0005794, GO:0016020, GO:0017119, GO:0000139
121005 GO:0005576
155158 GO:0005488
注：topGO包中的geneid2go實例數據只有100個基因
file = system.file("examples/geneid2go.map",
package="topGO")
gene2GO_data <- readMappings(file)
2.2 讀入（測序研究或芯片研究中的）所有基因【不帶score】
geneNames <- names(geneSymbol2go_list)
tail(geneNames)
## [1] "ZXDC" "ZYG11A" "ZYG11B" "ZYX" "ZZEF1" "ZZZ3"
假設我們的芯片中所有基因為geneNames向量中的所有基因，所得的差異基因為200個：
set.seed(2018-04-25)
myInterestingGenes <- sample(geneNames, 200)
tail(myInterestingGenes)
## [1] "PARG" "MIOX" "ERGIC2" "CHST10" "FOXR2" "FAM89B"
構建的geneLIst_nscore變量如下，其中geneLIst包括所有的基因，差異基因的值為1，否則為0，其名稱為基因的ID：
geneList_nscore <- factor(as.integer(geneNames %in% myInterestingGenes))
names(geneList_nscore) <- geneNames
tail(geneList_nscore)
## ZXDC ZYG11A ZYG11B ZYX ZZEF1 ZZZ3
## 0 0 0 0 0 0
## Levels: 0 1
2.4 讀入帶score的全部基因
library(ALL)
data(ALL)
library(genefilter)
selectedProbes <- genefilter(ALL, filterfun(pOverA(0.2, log2(100)),
function(x) (IQR(x) > 0.25)))
eset <- ALL[selectedProbes, ]
y <- as.integer((sapply(eset$BT,
function(x) return(substr(x, 1, 1)=="T"))))
y
## [1] 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
## [45] 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
## [89] 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
## 需要安裝multtest包才能自動調用該函數，該函數返回值為FDR
geneList <- getPvalues(exprs(eset), classlabel=y, alternative="two.sided")
其中geneList的值為p值，名稱為探針名；讀入geneList后再構建篩選差異基因的篩選函數
diffGenesFUN <- function(allScore) {
return(allScore < 0.05)
}
x <- diffGenesFUN(geneList)
sum(x)
## [1] 1018
geneList中有1018個是差異基因
2.3 構建topGOdata對象
GOdata_nscore_MF <- new("topGOdata",
ontology="MF",
allGenes=geneList_nscore,
annot=annFUN.gene2GO, gene2GO=geneSymbol2go_list,
nodeSize=5)
GOdata_nscore_MF
##
## ------------------------- topGOdata object -------------------------
##
## Description:
## -
##
## Ontology:
## - MF
##
## 20057 available genes (all genes from the array):
## - symbol: A0A075B6Q4 A0A087WUJ7 A0A087WUU8 A0A087WUV0 A0A087WV48 ...
## - 200 significant genes.
##
## 17630 feasible genes (genes that can be used in the analysis):
## - symbol: A0A087WUJ7 A0A087WUU8 A0A087WUV0 A0A087WV48 A0A087WW49 ...
## - 171 significant genes.
##
## GO graph (nodes with at least 5 genes):
## - a graph with directed edges
## - number of nodes = 1867
## - number of edges = 2501
##
## ------------------------- topGOdata object -------------------------
說明我們構建的topGOdata對象中共有20057個基因，其中差異基因有200個，經注釋的總基因有17630個，經注釋的差異基因有171個
GOdata_score_MF <- new("topGOdata",
ontology = "MF",
allGenes = geneList,
geneSelectionFun = diffGenesFUN,
annot = annFUN.db, affyLib = "hgu95av2.db",
nodeSize = 5)
GOdata_score_MF
##
## ------------------------- topGOdata object -------------------------
##
## Description:
## -
##
## Ontology:
## - MF
##
## 4101 available genes (all genes from the array):
## - symbol: 1000_at 1005_at 1007_s_at 1008_f_at 1009_at ...
## - score : 0.0068656 0.53047 2.148059e-09 1 0.00022923 ...
## - 1018 significant genes.
##
## 3875 feasible genes (genes that can be used in the analysis):
## - symbol: 1000_at 1005_at 1007_s_at 1008_f_at 1009_at ...
## - score : 0.0068656 0.53047 2.148059e-09 1 0.00022923 ...
## - 974 significant genes.
##
## GO graph (nodes with at least 5 genes):
## - a graph with directed edges
## - number of nodes = 993
## - number of edges = 1289
##
## ------------------------- topGOdata object -------------------------
##
對有注釋的和沒有注釋的基因數目進行可視化
allGenes <- featureNames(ALL)
group <- integer(length(allGenes))+1
group[allGenes %in% genes(GOdata_score_MF)] <- 0
group[!selectedProbes] <- 2
group <- factor(group,
labels=c("Used", "Not annotated", "Filtered"))
table(group)
## group
## Used Not annotated Filtered
## 3875 226 8524
pValues <- getPvalues(exprs(ALL), classlabel=y, alternative="two.sided")
geneVar <- apply(exprs(ALL), 1, var)
dd <- data.frame(x = geneVar[allGenes], y=log10(pValues[allGenes]), groups=group)
lattice::xyplot(y~x|group, data=dd, groups=group)
一個理想的圖是Used中的點基本都在右下，其余都在左上，由圖中可以看出被過濾掉的基因有很多都是顯著差異的，因此在實際應用中，過濾過程更[圖片上傳中...(1524667952526.png-4ef403-1524713389307-0)]
加保守
2.4 toGOdata對象的操作
2.4.1 描述
description(GOdata_score_MF)
## [1] "ALL data analysis Object modified on: 18-0425"
description(GOdata_score_MF) <- paste("ALL data analysis.",
"Object modified on:",
format(Sys.time(), "%y-%m%d"))
description(GOdata_score_MF)
## [1] "ALL data analysis. Object modified on: 18-0425"
2.4.2 獲取注釋的基因
head(genes(GOdata_score_MF))
## [1] "1000_at" "1005_at" "1007_s_at" "1008_f_at" "1009_at" "100_g_at"
numGenes(GOdata_score_MF)
## [1] 3875
2.4.3 獲取基因（有GO注釋）的分數（p值）
a <- geneScore(GOdata_score_MF,
whichGenes = names(geneList),
use.names=FALSE)
length(a)
## [1] 3875
length(geneList)
## [1] 4101
2.4.4 更新topGOdata數據
.geneList <- geneScore(GOdata_score_MF, use.names = TRUE)
GOdata_score_MF
##
## ------------------------- topGOdata object -------------------------
##
## Description:
## - ALL data analysis Object modified on: 18-0425
##
## Ontology:
## - MF
##
## 4101 available genes (all genes from the array):
## - symbol: 1000_at 1005_at 1007_s_at 1008_f_at 1009_at ...
## - score : 0.0068656 0.53047 2.148059e-09 1 0.00022923 ...
## - 1018 significant genes.
##
## 3875 feasible genes (genes that can be used in the analysis):
## - symbol: 1000_at 1005_at 1007_s_at 1008_f_at 1009_at ...
## - score : 0.0068656 0.53047 2.148059e-09 1 0.00022923 ...
## - 974 significant genes.
##
## GO graph (nodes with at least 5 genes):
## - a graph with directed edges
## - number of nodes = 993
## - number of edges = 1289
##
## ------------------------- topGOdata object -------------------------
##
updateGenes(GOdata_score_MF, .geneList, diffGenesFUN)
##
## ------------------------- topGOdata object -------------------------
##
## Description:
## - ALL data analysis Object modified on: 18-0425
##
## Ontology:
## - MF
##
## 3875 available genes (all genes from the array):
## - symbol: 1000_at 1005_at 1007_s_at 1008_f_at 1009_at ...
## - score : 0.0068656 0.53047 2.148059e-09 1 0.00022923 ...
## - 974 significant genes.
##
## 3875 feasible genes (genes that can be used in the analysis):
## - symbol: 1000_at 1005_at 1007_s_at 1008_f_at 1009_at ...
## - score : 0.0068656 0.53047 2.148059e-09 1 0.00022923 ...
## - 974 significant genes.
##
## GO graph (nodes with at least 5 genes):
## - a graph with directed edges
## - number of nodes = 993
## - number of edges = 1289
##
## ------------------------- topGOdata object -------------------------
##
2.4.5 GO terms的相關操作
- GO圖信息
graph(GOdata_score_MF)
## A graphNEL graph with directed edges
## Number of Nodes = 993
## Number of Edges = 1289
- 提取所有相關GO
allRelatedGO <- usedGO(GOdata_score_MF)
head(allRelatedGO)
## [1] "GO:0000049" "GO:0000149" "GO:0000166" "GO:0000175" "GO:0000217" "GO:0000287"
- 根據GO ID提取相關基因
selected.terms <- sample(usedGO(GOdata_score_MF), 10)
num.ann.genes <- countGenesInTerm(GOdata_score_MF, selected.terms)
num.ann.genes
## GO:0019209 GO:0000983 GO:0032357 GO:0019213 GO:0004198 GO:0042301 GO:0036459 GO:0001846
## 35 15 5 20 5 5 33 7
## GO:0005125 GO:0032451
## 27 18
ann.genes <- genesInTerm(GOdata_score_MF, selected.terms)
ann.genes[1:2]
## $`GO:0098973`
## [1] "32318_s_at" "34160_at" "AFFX-HSAC07/X00351_3_at"
## [4] "AFFX-HSAC07/X00351_3_st" "AFFX-HSAC07/X00351_5_at" "AFFX-HSAC07/X00351_M_at"
## $`GO:0099106`
## [1] "1158_s_at" "1336_s_at" "155_s_at" "160029_at" "1675_at" "31694_at"
## [7] "31900_at" "31901_at" "32498_at" "32558_at" "32715_at" "32749_s_at"
## [13] "33458_r_at" "34608_at" "34609_g_at" "34759_at" "34981_at" "36900_at"
## [19] "36935_at" "37184_at" "38516_at" "38604_at" "38774_at" "38831_f_at"
## [25] "39010_at" "39011_at" "41143_at" "41288_at" "457_s_at" "755_at"
## [31] "911_s_at" "955_at"
##
scoresInTerm(GOdata_score_MF, selected.terms)[1]
## $`GO:0098973`
## [1] 1.0000000 0.1708372 1.0000000 1.0000000 1.0000000 1.0000000
##
scoresInTerm(GOdata_score_MF, selected.terms, use.names = TRUE)[1]
## $`GO:0098973`
## 32318_s_at 34160_at AFFX-HSAC07/X00351_3_at
## 1.0000000 0.1708372 1.0000000
## AFFX-HSAC07/X00351_3_st AFFX-HSAC07/X00351_5_at AFFX-HSAC07/X00351_M_at
## 1.0000000 1.0000000 1.0000000
##
- 選擇相應的terms對基因及差異基因數目進行統計
termStat(GOdata_score_MF, selected.terms)
## Annotated Significant Expected
## GO:0098973 6 0 1.51
## GO:0099106 32 12 8.04
## GO:0009055 46 11 11.56
## GO:0001104 45 13 11.31
## GO:0005161 5 2 1.26
## GO:0017160 7 3 1.76
## GO:0051536 16 2 4.02
## GO:0016866 6 3 1.51
## GO:0005509 136 45 34.18
## GO:0098772 510 146 128.19
3. 富集統計分析
topGO支持的統計分析分為3類
- 根據基因數目進行的統計分析，只需提供一列基因名稱就能進行統計分析，Fisher精確檢驗，超幾何分布檢驗，二項分布檢驗都屬于這個家族
- 根據基因對應的分數或排序進行的檢驗，包括Kolmogorov-Smirnov檢驗（也稱為GSEA，ks檢驗），Gentleman分類，t檢驗等
- 根據基因表達數據進行統計檢驗，如Goeman全局檢驗等
topGOdata對象可以通過兩種方式運行統計檢驗，第一種可以讓用戶自己定義統計檢驗過程（高級R用戶），第二種更容易但也缺乏更多自定義的操作。
注：weight01是weight和elim的混合算法，默認模式即為weight01
3.1 方式1：定義和進行統計檢驗
進行富集分析的主要函數是getSigGroups()，包括兩個參數，第一個是topGOdata對象，第二個是groupStats類或他的衍生類，groupStats類及其子類的關系圖如下：
3.1.1 groupStats類
使用Fisher精確檢驗計算GO:0046961這個脂代謝term的富集程度，需要先定義所有基因，差異基因
goID <- "GO:0046961"
gene.universe <- genes(GOdata_score_MF)
go.genes <- genesInTerm(GOdata_score_MF, goID)[[1]]
go.genes
## [1] "32444_at" "33875_at" "34889_at" "35770_at" "36028_at" "36167_at" "36994_at" "37367_at"
## [9] "37395_at" "38686_at" "39326_at"
sig.genes <- sigGenes(GOdata_score_MF)
接下來就可以構建groupStats類了，classicCount類是groupStats的一個子類
my.group <- new("classicCount", testStatistic = GOFisherTest, name = "fisher", allMembers = gene.universe,
groupMembers = go.genes, sigMembers = sig.genes)
contTable(my.group)
## sig notSig
## anno 4 7
## notAnno 970 2894
# 可以直接使用runTest函數對groupStats對象進行統計檢驗
runTest(my.group)
## [1] 0.2902583
testStatistic參數代表進行統計量計算的函數，GOFisherTest是topGO包定義的函數，能進行Fisher精確檢驗，用戶能自定義該計算統計量的函數，name是注釋信息
除了ClassicCount類，elimCount類也是groupStats的子類，隨機排除25%的注釋
set.seed(2018 - 4 - 25)
elim.genes <- sample(go.genes, length(go.genes)/4)
elim.group <- new("elimCount", testStatistic = GOFisherTest, name = "fisher_elim", allMembers = gene.universe,
groupMembers = go.genes, sigMembers = sig.genes, elim = elim.genes)
contTable(elim.group)
## sig notSig
## anno 3 6
## notAnno 970 2894
# 可以直接使用runTest函數對groupStats對象進行統計檢驗
runTest(elim.group)
## [1] 0.1682705
注：groupStats類并不依賴于GO（由我們傳入的參數即可知道不管是GO還是KEGG等其他類型的集合均可適用）
3.1.2 進行假設檢驗
如果只適用基因列表進行假設檢驗則構建classicCount或elimCount對象
test.stat <- new("classicCount", testStatistic=GOFisherTest,
name="Fisher test")
resultFisher <- getSigGroups(GOdata_score_MF, test.stat)
resultFisher
##
## Description: ALL data analysis Object modified on: 18-0425
## Ontology: MF
## 'classic' algorithm with the 'Fisher test' test
## 993 GO terms scored: 50 terms with p < 0.01
## Annotation data:
## Annotated genes: 3875
## Significant genes: 974
## Min. no. of genes annotated to a GO: 5
## Nontrivial nodes: 905
如果同時適用score，則需構建classicScore或elimScore對象（如上圖所示）
test.stat <- new("classicScore", testStatistic = GOKSTest, name = "KS test")
resultKS <- getSigGroups(GOdata_score_MF, test.stat)
resultKS
##
## Description: ALL data analysis Object modified on: 18-0425
## Ontology: MF
## 'classic' algorithm with the 'KS test' test
## 993 GO terms scored: 65 terms with p < 0.01
## Annotation data:
## Annotated genes: 3875
## Significant genes: 974
## Min. no. of genes annotated to a GO: 5
## Nontrivial nodes: 993
test.stat <- new("elimScore", testStatistic = GOKSTest, name = "KS test elim")
resultKSElim <- getSigGroups(GOdata_score_MF, test.stat)
resultKSElim
##
## Description: ALL data analysis Object modified on: 18-0425
## Ontology: MF
## 'elim' algorithm with the 'KS test elim : 0.01' test
## 993 GO terms scored: 32 terms with p < 0.01
## Annotation data:
## Annotated genes: 3875
## Significant genes: 974
## Min. no. of genes annotated to a GO: 5
## Nontrivial nodes: 993
注意選擇的class與檢驗方法的兼容性，如上圖所示，weight不能與score相關的檢驗兼容，而與Fisher test兼容
test.stat <- new("weightCount", testStatistic = GOFisherTest,
name = "Fisher test", sigRatio = "ratio")
resultFisherWeight <- getSigGroups(GOdata_score_MF, test.stat)
resultFisherWeight
##
## Description: ALL data analysis Object modified on: 18-0425
## Ontology: MF
## 'weight' algorithm with the 'Fisher test : ratio' test
## 993 GO terms scored: 20 terms with p < 0.01
## Annotation data:
## Annotated genes: 3875
## Significant genes: 974
## Min. no. of genes annotated to a GO: 5
## Nontrivial nodes: 905
3.2 P值是否校正的問題
注意檢驗所得p值為原始p值，未經過多重檢驗校正，不校正的原因如下：
- 在很多情況下，富集分析得到的p值的分布可能不太極端，在這些情況下FDR或FWER校正方法產生較為保守的p值，導致沒有“顯著”的p值，丟失重要的GO terms及相關信息，在這種情況下，研究者往往關注GO terms的排序，而不是它們是否有一個顯著的FDR。
- 富集分析包括了多個步驟和許多假設，如對GO terms進行的Fisher精確檢驗。進行多重檢驗校正遠遠不足以控制誤差率。
- 對elim和weight的檢驗方法來說，多重檢驗校正的方法變得更加不可靠，因為用這些方法就算的p值是依賴于相鄰的GO term的，而多重檢驗校正的前提假設是這些檢驗都是獨立的。
3.3 更高層面的統計檢驗（用戶友好）
用runTest函數可以很快速的進行統計檢驗，統計方法的選擇通過algorithm（默認為weigth01）和statistc參數決定，如
resultFis <- runTest(GOdata_score_MF,
algorithm="classic",
statistic="fisher")
weight01.fisher <- runTest(GOdata_score_MF,
statistic = "fisher")
weight01.t <- resultt<- runTest(GOdata_score_MF,
algorithm="weight01",
statistic="t")
elim.ks <- resultt<- runTest(GOdata_score_MF,
algorithm="elim",
statistic="ks")
可用的參數如下（也可以看上面的圖），注意有些組合不兼容
whichTests()
## [1] "fisher" "ks" "t" "globaltest" "sum" "ks.ties"
whichAlgorithms()
## [1] "classic" "elim" "weight" "weight01" "lea" "parentchild"
4. 富集結果及可視化
4.1 topGOresult對象
toGOresult對象非常簡單，只有p值或統計量（統稱為score），score函數并沒有對返回值進行排序
pvalFis <- score(resultFis)
head(pvalFis)
## GO:0000049 GO:0000149 GO:0000166 GO:0000175 GO:0000217 GO:0000287
## 0.9383324 0.9779475 0.3904532 0.8241708 0.3247581 0.3125296
可用統計這些score的分布
hist(pvalFis, 100, xlab="p-values")
score函數還有一個參數whichGO，可以指定GO ID
pvalWeight <- score(resultFisherWeight, whichGO = names(pvalFis))
head(pvalWeight)
## GO:0000049 GO:0000149 GO:0000166 GO:0000175 GO:0000217 GO:0000287
## 0.9383324 0.9806822 0.7372081 0.8241708 0.3247581 0.3125296
可以看一下不同方法的結果相關性：
cor(pvalFis, pvalWeight)
## [1] 0.6590391
plot(pvalFis, pvalWeight,
xlab = "p-value classic", ylab = "p-value elim",
pch = 19, cex = gSize, col = 1:2)
也可以對結果進行簡單統計（總共注釋的基因，注釋的差異基因，最少包含的基因數，包含差異基因的GO term）
geneData(resultFisherWeight)
## Annotated Significant NodeSize SigTerms
## 3875 974 5 905
4.2 匯總結果
使用GenTable函數可以對結果進行匯總，參數為toGOdata和toGOresult，及制定排序的列及包含的條目
allRes <- GenTable(GOdata_score_MF, classic = resultFis,
KS = resultKS, weight = resultFisherWeight,
orderBy = "weight",
ranksOf = "classic", topNodes = 20)
4.3 分析單個GO term
最直觀地查看某個GO term是否有差異基因富集的方法就是觀察score的密度分布
## 選擇第一個GO term
goID <- allRes[1, "GO.ID"]
print(showGroupDensity(GOdata_score_MF, goID, ranks=TRUE))
如圖所示，橫坐標表示由score產生的排序位置，縱坐標表示密度
上圖表示注釋到該特定GO中的所有基因的密度分布，下圖表示除了上圖基因之外的其他基因的密度分布，該特定GO中的基因大多分布在p值較低的位置區域，而下方的圖表示p值的分布基本都在一個比較均勻的水平，說明富集比較顯著
另一個比較方便的功能是把該GO中的所有基因及其注釋信息和p值匯總成表，可以使用whichTerms參數指定GO terms，如果有過個GO則返回一個含有dataframe的list，還可以傳遞file參數指定輸出文件（注：只有該芯片有注釋包時才能使用該函數，其余自定義的注釋不能使用該函數）
gt <- printGenes(GOdata_score_MF,
whichTerms = goID,
chip = affyLib,
numChar = 40)
4.4 可視化GO層級結構
兩個函數實現，一是showSigOfNodes，firstSigNodes表示指定的顯著節點數目，useInfo表示每個節點的信息顯示包括“def”（GOid及定義文字）和“all”（GOid定義文字，score和注釋數目【包括該term的基因在總基因中國的數目，和該term的基因在差異基因中的數目】），其中顯著富集的GO用長方形表示，黑色箭頭代表is_a關系，紅色箭頭代表part_a關系，節點的顏色代表其顯著性的程度。
showSigOfNodes(GOdata_score_MF,
score(resultFisherWeight),
firstSigNodes = 5,
useInfo = 'def')
printGraph函數自動輸出為pdf文件保存在當前目錄，fn.prefix表示輸出文件的前綴文字
printGraph(GOdata_score_MF, resultFis,
firstSigNodes = 10,
fn.prefix = "tGO",
useInfo = "all",
pdfSW = TRUE)
本次GO分析的缺陷：
1.對探針進行GO分析而不是基因名進行GO分析，這樣會導致相應GO term的counts數目不正確，如一個探針對應多個基因的情況
- 可以通過構建限定level和證據級別的GO注釋對象，從而限定level等級和證據等級進行富集分析
