作者：路子
審稿：童蒙
編輯：angelica
細(xì)胞位置信息對于干細(xì)胞分化，組織發(fā)育以及腫瘤組織微環(huán)境起著重大的作用，那么空間轉(zhuǎn)錄組在這些研究領(lǐng)域中是如何設(shè)計如何解決科學(xué)問題的呢？跟著小編一探究竟吧。
之前跟大家一起瀏覽了10X Genomics Visium 空間轉(zhuǎn)錄組的分析流程（不可錯過的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究新維度：空間轉(zhuǎn)錄組）
，這次跟大家分享一下空間轉(zhuǎn)錄組的應(yīng)用領(lǐng)域以及研究的思路。
根據(jù)10X Genomics 官網(wǎng)上公布的利用ST（Spatial Transcriptomics）技術(shù)進(jìn)行研究的文獻(xiàn)，可以看到該技術(shù)涵蓋了腫瘤、發(fā)育、疾病等領(lǐng)域，涉及到腫瘤、淋巴、大腦、心臟等各種組織。同時空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)除了可以應(yīng)用在常見的哺乳動物，也可以應(yīng)用在植物學(xué)的研究上。
1. 應(yīng)用領(lǐng)域—腫瘤
我們以2020年1月份發(fā)表在Nature Biotechnology 上，對PDAC（胰腺導(dǎo)管腺癌）的研究為例，探討下空間轉(zhuǎn)錄組在腫瘤生物學(xué)方面的研究。
該研究主要整合了原ST技術(shù)和單細(xì)胞RNA技術(shù)，彌補(bǔ)了原ST分辨率較低、單細(xì)胞RNA缺乏空間信息的缺點，兩者互相補(bǔ)充，實現(xiàn)了單細(xì)胞水平加空間的全面無偏的癌癥組織分析。
1.1研究問題
1.探究PDAC組織的細(xì)胞類型，以及與空間相關(guān)的細(xì)胞亞型
2.探究不同腫瘤樣本微環(huán)境特點
1.2研究實驗設(shè)計
如上圖所示，作者分兩條線進(jìn)行設(shè)計分析，取兩名PDAC患者的2例新鮮PDAC-A和B腫瘤組織，同時進(jìn)行scRNA-seq和ST建庫測序分析。
- scRNA-seq 分析流程：制備細(xì)胞懸浮液—Droplet-based 文庫制備—測序—信息分析（鑒定細(xì)胞群體類型）
- ST-seq分析流程：制備組織切片—建庫—測序—信息分析（組織空間成像點表達(dá)情況)
- 最后通過引入多模式相交分析（Multimodal intersection analysis，MIA）整合scRNA和ST數(shù)據(jù)集進(jìn)行空間區(qū)域的細(xì)胞亞群分類。
1.3分析思路與結(jié)果總結(jié)
scRNA-seq 細(xì)胞分類：利用CNV和細(xì)胞分類分析以及熒光標(biāo)記實驗證實了PDAC-A包含兩種癌癥細(xì)胞群cluster1(TM4SF1)和cluster2(S100A4)，PDAC-B包含一種癌癥細(xì)胞群cluster1（TM4SF1）。
ST-seq細(xì)胞分群：依據(jù)病理學(xué)進(jìn)行組織分區(qū)，計算Spots表達(dá)水平進(jìn)行PCA分類，發(fā)現(xiàn)cluster與組織分類是一致的。
MIA算法整合分析：
1.發(fā)現(xiàn)在組織空間受限區(qū)域中含有特定的細(xì)胞類型和特定細(xì)胞亞群的富集。例如PDAC-A的成纖維細(xì)胞特異性基因與ST分析結(jié)果中的特定區(qū)域的一組基因具有很強(qiáng)的一致性；除此之外，還發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)管上皮區(qū)域富含導(dǎo)管細(xì)胞，胰腺組織區(qū)域富含腺泡細(xì)胞和分泌細(xì)胞。
2.依據(jù)MIA結(jié)果繪制了不同腫瘤樣本微環(huán)境的特點、免疫環(huán)境狀態(tài)、應(yīng)激水平以及細(xì)胞之間相互作用的模式，有助于對患者預(yù)后進(jìn)行預(yù)判。
熒光實驗驗證：利用免疫熒光標(biāo)記實驗進(jìn)行結(jié)果驗證。
1.4 總結(jié)
該文章的一大亮點是引入了MIA算法進(jìn)行空間和單細(xì)胞的整合，目前10X Genomics visium 系統(tǒng)大大提升了空間分辨率，一個Spot大概包含1-10個單細(xì)胞（主要受研究的組織細(xì)胞直徑的影響），幾乎接近單細(xì)胞水平。
2.應(yīng)用領(lǐng)域—組織發(fā)育
接下來我們一起看一下，發(fā)表在Cell上一篇關(guān)于人類心臟研究的文章，充分發(fā)揮了空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，全方位展示了單細(xì)胞空間分辨率下的全器官模式。
該研究利用空間轉(zhuǎn)錄組（ST）、單細(xì)胞（scRNA）和原位測序（in situ sequencing，ISS）技術(shù)進(jìn)行聯(lián)合分析，最終獲得了人類心臟發(fā)育的時間、空間的基因表達(dá)模式，并深入探討了不同類型細(xì)胞的功能。同時創(chuàng)建了人類胚胎心臟的公共網(wǎng)絡(luò)資源，共享研究數(shù)據(jù)和成果。
2.1研究設(shè)計
研究設(shè)計如上圖所示，取來自3個人的孕4.5-5周、6.5周和9周的心臟組織，采用ST、scRNA 和原位測序三種技術(shù)手段，從時間、空間兩個維度展示了人類心臟發(fā)育表達(dá)的模式。
- ST：組織切片—建庫—測序—信息分析（降維聚類，細(xì)胞分類）
- scRNA-seq：細(xì)胞懸液—建庫—測序—信息分析（降維聚類，細(xì)胞分類）
- ISS：獲得基因表達(dá)的位置信息
- 最后，結(jié)合三種技術(shù)進(jìn)行人類胚胎心臟3D建模，構(gòu)建了全方位組織基因表達(dá)圖譜。
2.2分析思路與結(jié)果總結(jié)
STseq分析：對不同孕期的胚胎心臟切片進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析，經(jīng)過降維聚類，差異表達(dá)等分析，最終獲得了10個cluster細(xì)胞類型，并標(biāo)注了10個cluster特異性表達(dá)的基因。
scRNAseq分析：對孕6.5周胚胎心臟分割兩部分進(jìn)行scRNA建庫測序分析，經(jīng)過降維聚類，獲得15個cluster細(xì)胞類型，鑒定到的細(xì)胞類型與先前報道一致。
ISS分析：利用ISS的亞細(xì)胞空間分辨率的特性，運用pciSeq方法創(chuàng)建了一個綜合概率，確定scRNA定義的細(xì)胞類型的空間細(xì)胞圖譜，從而實現(xiàn)單細(xì)胞分辨率的基因表達(dá)時空分析。
作者把運用這三種技術(shù)整合的人類胚胎心臟發(fā)育的時空基因表達(dá)圖譜數(shù)據(jù)提交到一個公共網(wǎng)站上，以共享數(shù)據(jù)成果。https://hdca-sweden.scilifelab.se/a-study-on-human-heart-development/
2.3總結(jié)
ISS技術(shù)是2013年發(fā)表在Nature Methods 上的一篇文章，主要講述了這種擴(kuò)增測序方法。滾環(huán)擴(kuò)增：這種方法依賴一種鎖式（padlock）探針，它與目標(biāo)序列的任一側(cè)雜交，以形成環(huán)狀模板，進(jìn)行復(fù)制。由于產(chǎn)物是拴在模板上的，這提供了可靠定位，并可通過連續(xù)的寡核苷酸探針摻入，實現(xiàn)原位測序。這項技術(shù)一般用于序列（RNA，基因）組織細(xì)胞定位驗證分析。
3. 應(yīng)用領(lǐng)域—疾病
關(guān)于ST技術(shù)在疾病研究領(lǐng)域的介紹，我們以2019年12月發(fā)表在Scientific Reports 上的一篇關(guān)于關(guān)節(jié)炎的研究為例，一起探討下這項技術(shù)的應(yīng)用思路。
該研究主要利用ST空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，探索了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）和脊柱關(guān)節(jié)炎（SpA）的炎癥信號通路。揭示了在RA中，適應(yīng)性免疫反應(yīng)與T-B細(xì)胞相互作用，而在SpA中，適應(yīng)性免疫反應(yīng)與組織修復(fù)功能相關(guān)。
3.1研究設(shè)計
研究設(shè)計如上圖所示，分別取RA和SpA各3名患者，取其髖部或者膝蓋處的滑膜組織進(jìn)行ST建庫測序分析，揭示了慢性炎癥性疾病的細(xì)胞機(jī)制和在組織中的功能的多樣性。例如在RA中，適應(yīng)性免疫反應(yīng)與T-B細(xì)胞相互作用，而在SpA中，適應(yīng)性免疫反應(yīng)與組織修復(fù)功能相關(guān)。
3.2分析思路和結(jié)果總結(jié)
ST分析：取每個患者病患處3個部位滑膜組織，每個患者3個部位的數(shù)據(jù)合并在一起作為一個bulk對單個組織切片進(jìn)行糾正對比。由bulk和單個組織差異表達(dá)分析來看，RA與T細(xì)胞、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）關(guān)聯(lián)更強(qiáng)，而SpA組織的特征更多在于軟骨損傷和修復(fù)系統(tǒng)的過程。
功能分析：利用Ingenuity Pathway Analysis (IPA) and Metascape (http://metascape.org)軟件對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能和分子網(wǎng)絡(luò)通路分析，發(fā)現(xiàn)RA與適應(yīng)性免疫應(yīng)答相關(guān)，SpA與細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)、與軟骨損傷修復(fù)過程相關(guān)。
細(xì)胞類型鑒定：利用Xcell軟件進(jìn)行細(xì)胞類型的鑒定，展現(xiàn)了空間組織區(qū)域細(xì)胞的類型。
4. 應(yīng)用領(lǐng)域—植物學(xué)
前面介紹了人類腫瘤、發(fā)育和疾病相關(guān)的研究，那么ST技術(shù)能否應(yīng)用于植物學(xué)上，為農(nóng)林研究貢獻(xiàn)一種新技術(shù)、新方案呢？答案是肯定的。下面這篇就是2017年發(fā)表在Nature Plant 雜志上的一篇關(guān)于植物學(xué)的研究。
該研究利用空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)首先在被子植物和裸子植物中模擬了生成空間轉(zhuǎn)錄組圖譜的可行性，并且在擬南芥中識別了141個表達(dá)差異基因和花序組織區(qū)域的功能通路上的189個差異基因。空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)與功能學(xué)結(jié)合研究，將為植物發(fā)育、進(jìn)化等研究帶來新的思路和新的方法。
4.1研究設(shè)計
研究設(shè)計如上圖所示。作者對待研究的植物進(jìn)行取樣，如擬南芥花序、銀杏芽等一些植物進(jìn)行取樣，切片，建庫測序分析。
4.2分析思路和結(jié)果總結(jié)
1.討論被子植物和裸子植物空間轉(zhuǎn)錄技術(shù)的可行性
a.展示了金銀花的葉子芽在一年四季的形態(tài)；b.金銀花葉子芽兩個發(fā)育中和休眠中的葉芽基因表達(dá)熱圖，每個顏色條代表一個橫截切面，黑色箭頭指示位置表示空間Spots的基因表達(dá)較低；c.展示不同組織切片空間位點PCA的情況，i為雌性錐組織切片Spots PCA；ii 為不同的組織結(jié)構(gòu)（PT/LO）PCA；d.表明每個Spots的基因和轉(zhuǎn)錄本數(shù)量在擬南芥中復(fù)制。黑線表示每個重復(fù)中每個Spots的平均基因或轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量；由b和c的PCA圖示可以看到空間轉(zhuǎn)錄組信息（Spots）是可以區(qū)分組織差異性的。
2.空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)可用于擬南芥花序分化的分析
a.每個基因在空間上的表達(dá)水平。檢測到基因表達(dá)情況用顏色斑點進(jìn)行表示。b.擬南芥空間Spots分層聚類（t-SNE分析）。c.微觀領(lǐng)域級別的組織域分類用于線性模型分析。d.組織微類別中141個差異基因檢驗水平。綠點，實際數(shù)據(jù)中的P值；紅點，隨機(jī)排列斑點標(biāo)簽后的P值；垂直虛線為排列后的P值的0.1％分位數(shù)（大約等于0.001），證實了模型的正確性，并用于估計FDR）；水平虛線為任意閾值P（H0）= 0.05。e.列舉線性模型中在組織區(qū)域微類別之間的差異表達(dá)基因。f.花序組織區(qū)域功能通路上的189個差異基因。顏色編碼如d中所示。g.線性模型檢測到的功能通路的例子。由擬南芥的研究可以知道空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)識別了141個表達(dá)差異基因和花序組織區(qū)域的功能通路上的189個差異基因。空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)合功能學(xué)研究，將有助于更好的理解研究植物的進(jìn)化和發(fā)育。
4.3總結(jié)
這是ST技術(shù)發(fā)表以來，唯一應(yīng)用于植物學(xué)研究的文章，實際經(jīng)驗還不足，尤其植物樣本受到細(xì)胞壁，液泡，葉綠體和次生代謝產(chǎn)物的影響，需要對待研究的樣本進(jìn)行特定的優(yōu)化。
舉一反三的研究思路，加上ST升級版的10X Genomics Visium ，相信空間轉(zhuǎn)錄組會得到更廣泛，更深入的應(yīng)用。
參考文獻(xiàn)
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