什么是高通量測序？

高通量測序技術(shù)（High-throughput sequencing，HTS）是對傳統(tǒng)Sanger測序（稱為一代測序技術(shù)）革命性的改變,一次對幾十萬到幾百萬條核酸分子進行序列測定, 因此在有些文獻中稱其為下一代測序技術(shù)(next generation sequencing，NGS )足見其劃時代的改變, 同時高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細(xì)致全貌的分析成為可能, 所以又被稱為深度測序(Deep sequencing)。

什么是Sanger法測序（一代測序）

Sanger法測序利用一種DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應(yīng)構(gòu)成，每個反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進行檢測。

什么是基因組重測序（Genome Re-sequencing）

全基因組重測序是對基因組序列已知的個體進行基因組測序，并在個體或群體水平上進行差異性分析的方法。隨著基因組測序成本的不斷降低，人類疾病的致病突變研究由外顯子區(qū)域擴大到全基因組范圍。通過構(gòu)建不同長度的插入片段文庫和短序列、雙末端測序相結(jié)合的策略進行高通量測序，實現(xiàn)在全基因組水平上檢測疾病關(guān)聯(lián)的常見、低頻、甚至是罕見的突變位點，以及結(jié)構(gòu)變異等，具有重大的科研和產(chǎn)業(yè)價值。

什么是de novo測序

de novo測序也稱為從頭測序：其不需要任何現(xiàn)有的序列資料就可以對某個物種進行測序，利用生物信息學(xué)分析手段對序列進行拼接，組裝，從而獲得該物種的基因組圖譜。獲得一個物種的全基因組序列是加快對此物種了解的重要捷徑。隨著新一代測序技術(shù)的飛速發(fā)展，基因組測序所需的成本和時間較傳統(tǒng)技術(shù)都大大降低，大規(guī)模基因組測序漸入佳境，基因組學(xué)研究也迎來新的發(fā)展契機和革命性突破。利用新一代高通量、高效率測序技術(shù)以及強大的生物信息分析能力，可以高效、低成本地測定并分析所有生物的基因組序列。

什么是外顯子測序（whole exon sequencing）

外顯子組測序是指利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進行高通量測序的基因組分析方法。外顯子測序相對于基因組重測序成本較低，對研究已知基因的SNP、Indel等具有較大的優(yōu)勢，但無法研究基因組結(jié)構(gòu)變異如染色體斷裂重組等。

什么是mRNA測序 （RNA-seq）

轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics）是在基因組學(xué)后新興的一門學(xué)科，即研究特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA（包括mRNA和非編碼RNA）的類型與拷貝數(shù)。Illumina提供的mRNA測序技術(shù)可在整個mRNA領(lǐng)域進行各種相關(guān)研究和新的發(fā)現(xiàn)。mRNA測序不對引物或探針進行設(shè)計，可自由提供關(guān)于轉(zhuǎn)錄的客觀和權(quán)威信息。研究人員僅需要一次試驗即可快速生成完整的poly-A尾的RNA完整序列信息，并分析基因表達、cSNP、全新的轉(zhuǎn)錄、全新異構(gòu)體、剪接位點、等位基因特異性表達和罕見轉(zhuǎn)錄等最全面的轉(zhuǎn)錄組信息。簡單的樣品制備和數(shù)據(jù)分析軟件支持在所有物種中的mRNA測序研究。

什么是small RNA測序

Small RNA（micro RNAs、siRNAs和 pi RNAs）是生命活動重要的調(diào)控因子，在基因表達調(diào)控、生物個體發(fā)育、代謝及疾病的發(fā)生等生理過程中起著重要的作用。Illumina能夠?qū)?xì)胞或者組織中的全部Small RNA進行深度測序及定量分析等研究。實驗時首先將18-30 nt范圍的Small RNA從總RNA中分離出來，兩端分別加上特定接頭后體外反轉(zhuǎn)錄做成cDNA再做進一步處理后，利用測序儀對DNA片段進行單向末端直接測序。通過Illumina對Small RNA大規(guī)模測序分析，可以從中獲得物種全基因組水平的miRNA圖譜，實現(xiàn)包括新miRNA分子的挖掘，其作用靶基因的預(yù)測和鑒定、樣品間差異表達分析、miRNAs聚類和表達譜分析等科學(xué)應(yīng)用。

什么是miRNA測序

成熟的microRNA（miRNA）是17~24nt的單鏈非編碼RNA分子，通過與mRNA相互作用影響目標(biāo)mRNA的穩(wěn)定性及翻譯，最終誘導(dǎo)基因沉默，調(diào)控著基因表達、細(xì)胞生長、發(fā)育等生物學(xué)過程。基于第二代測序技術(shù)的microRNA測序，可以一次性獲得數(shù)百萬條microRNA序列，能夠快速鑒定出不同組織、不同發(fā)育階段、不同疾病狀態(tài)下已知和未知的microRNA及其表達差異，為研究microRNA對細(xì)胞進程的作用及其生物學(xué)影響提供了有力工具。

什么是Chip-seq

染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChromatinImmunoprecipitation，ChIP）也稱結(jié)合位點分析法，是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的有力工具，通常用于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點或組蛋白特異性修飾位點的研究。將ChIP與第二代測序技術(shù)相結(jié)合的ChIP-Seq技術(shù)，能夠高效地在全基因組范圍內(nèi)檢測與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段。

ChIP-Seq的原理是：首先通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，并對其進行純化與文庫構(gòu)建；然后對富集得到的DNA片段進行高通量測序。研究人員通過將獲得的數(shù)百萬條序列標(biāo)簽精確定位到基因組上，從而獲得全基因組范圍內(nèi)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段信息。

什么是CHIRP-Seq

CHIRP-Seq( Chromatin Isolation by RNA Purification )是一種檢測與RNA綁定的DNA和蛋白的高通量測序方法。方法是通過設(shè)計生物素或鏈霉親和素探針，把目標(biāo)RNA拉下來以后，與其共同作用的DNA染色體片段就會附在到磁珠上，最后把染色體片段做高通量測序，這樣會得到該RNA能夠結(jié)合到在基因組的哪些區(qū)域，但由于蛋白測序技術(shù)不夠成熟，無法知道與該RNA結(jié)合的蛋白。

什么是RIP-seq

RNA Immunoprecipitation是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)，是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動態(tài)過程的有力工具，能幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點。這種技術(shù)運用針對目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來，然后經(jīng)過分離純化就可以對結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進行測序分析。

RIP可以看成是普遍使用的染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術(shù)的類似應(yīng)用，但由于研究對象是RNA-蛋白復(fù)合物而不是DNA-蛋白復(fù)合物，RIP實驗的優(yōu)化條件與ChIP實驗不太相同（如復(fù)合物不需要固定，RIP反應(yīng)體系中的試劑和抗體絕對不能含有RNA酶，抗體需經(jīng)RIP實驗驗證等等）。RIP技術(shù)下游結(jié)合microarray技術(shù)被稱為RIP-Chip，幫助我們更高通量地了解癌癥以及其它疾病整體水平的RNA變化。

什么是CLIP-seq

CLIP-seq,又稱為HITS-CLIP，即紫外交聯(lián)免疫沉淀結(jié)合高通量測序(crosslinking-immunprecipitation and high-throughput sequencing), 是一項在全基因組水平揭示RNA分子與RNA結(jié)合蛋白相互作用的革命性技術(shù)。其主要原理是基于RNA分子與RNA結(jié)合蛋白在紫外照射下發(fā)生耦聯(lián)，以RNA結(jié)合蛋白的特異性抗體將RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體沉淀之后，回收其中的RNA片段，經(jīng)添加接頭、RT-PCR等步驟，對這些分子進行高通量測序，再經(jīng)生物信息學(xué)的分析和處理、總結(jié)，挖掘出其特定規(guī)律，從而深入揭示RNA結(jié)合蛋白與RNA分子的調(diào)控作用及其對生命的意義。

什么是metagenomic（宏基因組）：

Magenomics研究的對象是整個微生物群落。相對于傳統(tǒng)單個細(xì)菌研究來說，它具有眾多優(yōu)勢，其中很重要的兩點：(1)微生物通常是以群落方式共生于某一小生境中，它們的很多特性是基于整個群落環(huán)境及個體間的相互影響的，因此做Metagenomics研究比做單個個體的研究更能發(fā)現(xiàn)其特性；(2) Metagenomics研究無需分離單個細(xì)菌，可以研究那些不能被實驗室分離培養(yǎng)的微生物。

宏基因組是基因組學(xué)一個新興的科學(xué)研究方向。宏基因組學(xué)（又稱元基因組學(xué)，環(huán)境基因組學(xué)，生態(tài)基因組學(xué)等），是研究直接從環(huán)境樣本中提取的基因組遺傳物質(zhì)的學(xué)科。傳統(tǒng)的微生物研究依賴于實驗室培養(yǎng)，元基因組的興起填補了無法在傳統(tǒng)實驗室中培養(yǎng)的微生物研究的空白。過去幾年中，DNA測序技術(shù)的進步以及測序通量和分析方法的改進使得人們得以一窺這一未知的基因組科學(xué)領(lǐng)域。

什么是SNP、SNV（單核苷酸位點變異）

單核苷酸多態(tài)性singlenucleotide polymorphism，SNP 或單核苷酸位點變異SNV。個體間基因組DNA序列同一位置單個核苷酸變異(替代、插入或缺失)所引起的多態(tài)性。不同物種、個體基因組DNA序列同一位置上的單個核苷酸存在差別的現(xiàn)象。有這種差別的基因座、DNA序列等可作為基因組作圖的標(biāo)志。人基因組上平均約每1000個核苷酸即可能出現(xiàn)1個單核苷酸多態(tài)性的變化，其中有些單核苷酸多態(tài)性可能與疾病有關(guān)，但可能大多數(shù)與疾病無關(guān)。單核苷酸多態(tài)性是研究人類家族和動植物品系遺傳變異的重要依據(jù)。在研究癌癥基因組變異時，相對于正常組織，癌癥中特異的單核苷酸變異是一種體細(xì)胞突變（somatic mutation），稱做SNV。

什么是INDEL (基因組小片段插入）

基因組上小片段（>50bp）的插入或缺失，形同SNP/SNV。

什么是copy number variation （CNV）：基因組拷貝數(shù)變異

基因組拷貝數(shù)變異是基因組變異的一種形式，通常使基因組中大片段的DNA形成非正常的拷貝數(shù)量。例如人類正常染色體拷貝數(shù)是2，有些染色體區(qū)域拷貝數(shù)變成1或3，這樣，該區(qū)域發(fā)生拷貝數(shù)缺失或增加，位于該區(qū)域內(nèi)的基因表達量也會受到影響。如果把一條染色體分成A-B-C-D四個區(qū)域，則A-B-C-C-D/A-C-B-C-D/A-C-C-B-C-D/A-B-D分別發(fā)生了C區(qū)域的擴增及缺失，擴增的位置可以是連續(xù)擴增如A-B-C-C-D也可以是在其他位置的擴增，如A-C-B-C-D。

什么是structure variation （SV）：基因組結(jié)構(gòu)變異

染色體結(jié)構(gòu)變異是指在染色體上發(fā)生了大片段的變異。主要包括染色體大片段的插入和缺失（引起CNV的變化），染色體內(nèi)部的某塊區(qū)域發(fā)生翻轉(zhuǎn)顛換，兩條染色體之間發(fā)生重組（inter-chromosome trans-location）等。一般SV的展示利用Circos 軟件。

什么是Segment duplication

一般稱為SD區(qū)域，串聯(lián)重復(fù)是由序列相近的一些DNA片段串聯(lián)組成。串聯(lián)重復(fù)在人類基因多樣性的靈長類基因中發(fā)揮重要作用。在人類染色體Y和22號染色體上，有很大的SD序列。

什么是genotype and phenotype

既基因型與表型；一般指某些單核苷酸位點變異與表現(xiàn)形式間的關(guān)系。

什么是Read? 高通量測序平臺產(chǎn)生的序列標(biāo)簽就稱為reads。

什么是soft-clipped reads

當(dāng)基因組發(fā)生某一段的缺失，或轉(zhuǎn)錄組的剪接，在測序過程中，橫跨缺失位點及剪接位點的reads回帖到基因組時，一條reads被切成兩段，匹配到不同的區(qū)域，這樣的reads叫做soft-clipped reads，這些reads對于鑒定染色體結(jié)構(gòu)變異及外源序列整合具有重要作用。

什么是multi-hits reads

由于大部分測序得到的reads較短，一個reads能夠匹配到基因組多個位置，無法區(qū)分其真實來源的位置。一些工具根據(jù)統(tǒng)計模型，如將這類reads分配給reads較多的區(qū)域。

什么是Contig? 拼接軟件基于reads之間的overlap區(qū)，拼接獲得的序列稱為Contig（重疊群）。 什么是Scaffold? 基因組de novo測序，通過reads拼接獲得Contigs后，往往還需要構(gòu)建454 Paired-end庫或Illumina Mate-pair庫，以獲得一定大小片段（如3Kb、6Kb、10Kb、20Kb）兩端的序列。基于這些序列，可以確定一些Contig之間的順序關(guān)系，這些先后順序已知的Contigs組成Scaffold。 什么是Contig N50？ Reads拼接后會獲得一些不同長度的Contigs。將所有的Contig長度相加，能獲得一個Contig總長度。然后將所有的Contigs按照從長到短進行排序，如獲得Contig 1，Contig 2，Contig 3...………Contig 25。將Contig按照這個順序依次相加，當(dāng)相加的長度達到Contig總長度的一半時，最后一個加上的Contig長度即為Contig N50。舉例：Contig 1+Contig 2+ Contig 3+Contig 4=Contig總長度*1/2時，Contig 4的長度即為Contig N50。Contig N50可以作為基因組拼接的結(jié)果好壞的一個判斷標(biāo)準(zhǔn)。 什么是Scaffold N50？ Scaffold N50與Contig N50的定義類似。Contigs拼接組裝獲得一些不同長度的Scaffolds。將所有的Scaffold長度相加，能獲得一個Scaffold總長度。然后將所有的Scaffolds按照從長到短進行排序，如獲得Scaffold 1，Scaffold 2，Scaffold 3...………Scaffold 25。將Scaffold按照這個順序依次相加，當(dāng)相加的長度達到Scaffold總長度的一半時，最后一個加上的Scaffold長度即為Scaffold N50。舉例：Scaffold 1+Scaffold 2+ Scaffold 3 +Scaffold 4 +Scaffold 5=Scaffold總長度*1/2時，Scaffold 5的長度即為Scaffold N50。Scaffold N50可以作為基因組拼接的結(jié)果好壞的一個判斷標(biāo)準(zhǔn)。 什么是測序深度和覆蓋度？ 測序深度是指測序得到的總堿基數(shù)與待測基因組大小的比值。假設(shè)一個基因大小為2M，測序深度為10X，那么獲得的總數(shù)據(jù)量為20M。覆蓋度是指測序獲得的序列占整個基因組的比例。由于基因組中的高GC、重復(fù)序列等復(fù)雜結(jié)構(gòu)的存在，測序最終拼接組裝獲得的序列往往無法覆蓋有所的區(qū)域，這部分沒有獲得的區(qū)域就稱為Gap。例如一個細(xì)菌基因組測序，覆蓋度是98%，那么還有2%的序列區(qū)域是沒有通過測序獲得的。

什么是RPKM、FPKM

RPKM,Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads, is defined in thisway [Mortazavi etal., 2008]: 每1百萬個map上的reads中map到外顯子的每1K個堿基上的reads個數(shù)。 假如有1百萬個reads映射到了人的基因組上，那么具體到每個外顯子呢，有多少映射上了呢，而外顯子的長度不一，那么每1K個堿基上又有多少reads映射上了呢，這大概就是這個RPKM的直觀解釋。

如果對應(yīng)特定基因的話，那么就是每1000000 mapped到該基因上的reads中每kb有多少是mapped到該基因上的exon的read Total exon reads:This is the number in the column with header Total exonreads in the row for the gene. This is the number of reads that have beenmapped to a region in which an exon is annotated for the gene or across theboundaries of two exons or an intron and an exon for an annotated transcript ofthe gene. For eukaryotes, exons and their internal relationships are defined byannotations of type mRNA.映射到外顯子上總的reads個數(shù)。這個是映射到某個區(qū)域上的reads個數(shù)，這個區(qū)域或者是已知注釋的基因或者跨兩個外顯子的邊界或者是某個基因已經(jīng)注釋的轉(zhuǎn)錄本的內(nèi)含子、外顯子。對于真核生物來說，外顯子和它們自己內(nèi)部的關(guān)系由某類型的mRNA來注釋。

Exonlength: This is the number in the column with the header Exon length inthe row for the gene, divided by 1000. This is calculated as the sum of thelengths of all exons annotated for the gene. Each exon is included only once inthis sum, even if it is present in more annotated transcripts for the gene.Partly overlapping exons will count with their full length, even though theyshare the same region.外顯子的長度。計算時，計算所有某個基因已注釋的所有外顯子長度的總和。即使某個基因以多種注釋的轉(zhuǎn)錄本呈現(xiàn)，這個外顯子在求和時只被包含一次。即使部分重疊的外顯子共享相同的區(qū)域，重疊的外顯子以其總長來計算。 Mapped reads: The sum of all the numbers in the column with header Totalgene reads. The Total gene reads for a gene is the total number ofreads that after mapping have been mapped to the region of the gene. Thus thisincludes all the reads uniquely mapped to the region of the gene as well asthose of the reads which match in more places (below the limit set in thedialog in figure18.110) that have been allocated tothis gene's region. A gene's region is that comprised of the flanking regions(if it was specified in figure 18.110), the exons, the introns andacross exon-exon boundaries of all transcripts annotated for the gene. Thus,the sum of the total gene reads numbers is the number of mapped reads for thesample (you can find the number in the RNA-Seq report).map的reads總和。映射到某個基因上的所有reads總數(shù)。因此這包含所有的唯一映射到這個區(qū)域上的reads。

舉例：比如對應(yīng)到該基因的read有1000個，總reads個數(shù)有100萬，而該基因的外顯子總長為5kb，那么它的RPKM為：10^9*1000(reads個數(shù))/10^6(總reads個數(shù))*5000(外顯子長度)=200或者：1000(reads個數(shù))/1(百萬)*5(K)=200這個值反映基因的表達水平。

FPKM(fragments per kilobase of exon per million fragments mapped). FPKM與RPKM計算方法基本一致。不同點就是FPKM計算的是fragments，而RPKM計算的是reads。Fragment比read的含義更廣，因此FPKM包含的意義也更廣，可以是pair-end的一個fragment，也可以是一個read。

什么是轉(zhuǎn)錄本重構(gòu)

用測序的數(shù)據(jù)組裝成轉(zhuǎn)錄本。有兩種組裝方式：1，de-novo構(gòu)建； 2，有參考基因組重構(gòu)。其中de-novo組裝是指在不依賴參考基因組的情況下，將有overlap的reads連接成一個更長的序列，經(jīng)過不斷的延伸，拼成一個個的contig及scaffold。常用工具包括velvet，trans-ABYSS，Trinity等。有參考基因組重構(gòu)，是指先將read貼回到基因組上，然后在基因組通過reads覆蓋度，junction位點的信息等得到轉(zhuǎn)錄本，常用工具包括scripture、cufflinks。

什么是genefusion

將基因組位置不同的兩個基因中的一部分或全部整合到一起，形成新的基因，稱作融合基因，或嵌合體基因。該基因有可能翻譯出融合或嵌合體蛋白。

什么是表達譜

基因表達譜(geneexpression profile)：指通過構(gòu)建處于某一特定狀態(tài)下的細(xì)胞或組織的非偏性cDNA文庫,大規(guī)模cDNA測序,收集cDNA序列片段、定性、定量分析其mRNA群體組成,從而描繪該特定細(xì)胞或組織在特定狀態(tài)下的基因表達種類和豐度信息,這樣編制成的數(shù)據(jù)表就稱為基因表達譜

什么是功能基因組學(xué)

功能基因組學(xué)（Functuionalgenomics）又往往被稱為后基因組學(xué)（Postgenomics），它利用結(jié)構(gòu)基因組所提供的信息和產(chǎn)物，發(fā)展和應(yīng)用新的實驗手段，通過在基因組或系統(tǒng)水平上全面分析基因的功能，使得生物學(xué)研究從對單一基因或蛋白質(zhì)得研究轉(zhuǎn)向多個基因或蛋白質(zhì)同時進行系統(tǒng)的研究。這是在基因組靜態(tài)的堿基序列弄清楚之后轉(zhuǎn)入對基因組動態(tài)的生物學(xué)功能學(xué)研究。研究內(nèi)容包括基因功能發(fā)現(xiàn)、基因表達分析及突變檢測。基因的功能包括：生物學(xué)功能，如作為蛋白質(zhì)激酶對特異蛋白質(zhì)進行磷酸化修飾；細(xì)胞學(xué)功能，如參與細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)信號傳遞途徑；發(fā)育上功能，如參與形態(tài)建成等。采用的手段包括經(jīng)典的減法雜交，差示篩選，cDNA代表差異分析以及mRNA差異顯示等，但這些技術(shù)不能對基因進行全面系統(tǒng)的

分析，新的技術(shù)應(yīng)運而生，包括基因表達的系統(tǒng)分析（serial analysis of gene expression,SAGE），cDNA微陣列（cDNA microarray），DNA 芯片（DNA chip）和序列標(biāo)志片段顯示（sequence tagged fragmentsdisplay。

什么是比較基因組學(xué)

比較基因組學(xué)(ComparativeGenomics)是基于基因組圖譜和測序基礎(chǔ)上，對已知的基因和基因組結(jié)構(gòu)進行比較，來了解基因的功能、表達機理和物種進化的學(xué)科。利用模式生物基因組與人類基因組之間編碼順序上和結(jié)構(gòu)上的同源性，克隆人類疾病基因，揭示基因功能和疾病分子機制，闡明物種進化關(guān)系，及基因組的內(nèi)在結(jié)構(gòu)。

什么是表觀遺傳學(xué)

表觀遺傳學(xué)是研究基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達了可遺傳的變化的一門遺傳學(xué)分支學(xué)科。表觀遺傳的現(xiàn)象很多，已知的有DNA甲基化（DNAmethylation），基因組印記（genomicimpriting），母體效應(yīng)（maternaleffects），基因沉默（genesilencing），核仁顯性，休眠轉(zhuǎn)座子激活和RNA編輯（RNA editing）等。

什么是計算生物學(xué)

計算生物學(xué)是指開發(fā)和應(yīng)用數(shù)據(jù)分析及理論的方法、數(shù)學(xué)建模、計算機仿真技術(shù)等。當(dāng)前，生物學(xué)數(shù)據(jù)量和復(fù)雜性不斷增長，每14個月基因研究產(chǎn)生的數(shù)據(jù)就會翻一番，單單依靠觀察和實驗已難以應(yīng)付。因此，必須依靠大規(guī)模計算模擬技術(shù)，從海量信息中提取最有用的數(shù)據(jù)。

什么是基因組印記

基因組印記(又稱遺傳印記)是指基因根據(jù)親代的不同而有不同的表達。印記基因的存在能導(dǎo)致細(xì)胞中兩個等位基因的一個表達而另一個不表達。基因組印記是一正常過程，此現(xiàn)象在一些低等動物和植物中已發(fā)現(xiàn)多年。印記的基因只占人類基因組中的少數(shù)，可能不超過5%，但在胎兒的生長和行為發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。基因組印記病主要表現(xiàn)為過度生長、生長遲緩、智力障礙、行為異常。目前在腫瘤的研究中認(rèn)為印記缺失是引起腫瘤最常見的遺傳學(xué)因素之一。

什么是基因組學(xué)

基因組學(xué)（英文genomics），研究生物基因組和如何利用基因的一門學(xué)問。用于概括涉及基因作圖、測序和整個基因組功能分析的遺傳學(xué)分支。該學(xué)科提供基因組信息以及相關(guān)數(shù)據(jù)系統(tǒng)利用，試圖解決生物，醫(yī)學(xué)，和工業(yè)領(lǐng)域的重大問題。

什么是DNA甲基化

DNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共價鍵結(jié)合一個甲基基團。正常情況下，人類基因組“垃圾”序列的CpG二核苷酸相對稀少，并且總是處于甲基化狀態(tài)，與之相反，人類基因組中大小為100—1000 bp左右且富含CpG二核苷酸的CpG島則總是處于未甲基化狀態(tài)，并且與56％的人類基因組編碼基因相關(guān)。人類基因組序列草圖分析結(jié)果表明，人類基因組CpG島約為28890個，大部分染色體每1 Mb就有5—15個CpG島，平均值為每Mb含10．5個CpG島，CpG島的數(shù)目與基因密度有良好的對應(yīng)關(guān)系[9]。由于DNA甲基化與人類發(fā)育和腫瘤疾病的密切關(guān)系，特別是CpG島甲基化所致抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活問題，DNA甲基化已經(jīng)成為表觀遺傳學(xué)和表觀基因組學(xué)的重要研究內(nèi)容。

什么是基因組注釋？

基因組注釋(Genomeannotation) 是利用生物信息學(xué)方法和工具,對基因組所有基因的生物學(xué)功能進行高通量注釋,是當(dāng)前功能基因組學(xué)研究的一個熱點。基因組注釋的研究內(nèi)容包括基因識別和基因功能注釋兩個方面。基因識別的核心是確定全基因組序列中所有基因的確切位置。

什么是Q30？

Q30是指一個堿基的識別可靠性等于99.9%，或者說出錯可能性是0.1%。Q20則是指堿基識別的可靠性等于99%。

Q30數(shù)據(jù)量是指一批數(shù)據(jù)中，質(zhì)量高于等于Q30的數(shù)據(jù)的量的總和。

測序數(shù)據(jù)的PF data/PF reads是什么意思？

PF是pass filter的意思。也就是質(zhì)量合格的意思。Illumina的測儀序會自動地對一個read(序列)的質(zhì)量可靠性進行打分。

對于前25個堿基中的是否有兩個堿基的識別可靠性低于0.6，是PF的判斷標(biāo)準(zhǔn)。這句話翻譯成較容易理解的話: 就是前25個堿基中，如果低質(zhì)量的數(shù)據(jù)有2個或更多，則這條read被判定為不合格，PF就不通過。反之，則質(zhì)檢通過。

PF是國際公認(rèn)的質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)。

你們給的數(shù)據(jù)是什么質(zhì)量的？

對于哺乳動物基因組重測序、外顯子測序，我們保證數(shù)據(jù)質(zhì)量是Q30的比例高于80%。對于mRNA測序，smRNA測序，我們保證對照Lane的數(shù)據(jù)質(zhì)是Q30的比例高于80%。

一般情況下:

哺乳動物基因組重測序、外顯子測序，GC比例在40%左右，Q30的比例是80~95%

RNA-seq，GC比例在50%左右，Q30的比例是~80%。如果Poly(A)特別多的情況下，Q30會更低一些

SmRNA-seq，因為有許多的read讀通之后，只剩下一串的A，質(zhì)量會更低，我們的實驗結(jié)果%Q30在70~75%

測序中的Duplication是什么，如何避免，一般會有多少Duplication?

所謂Duplication是指起始與終止位置完全一致的片段。

引起Duplication的主要原因是因為在測序中有PCR過程，來源于同一個DNA片段PCR的產(chǎn)物被重復(fù)測序，就會是Duplication。次要原因是正巧兩個片段的頭和尾的位置完全一致。

一般通過控制PCR的循環(huán)數(shù)來控制Duplication。我們一般控制PCR的循環(huán)次數(shù)在10~12個循環(huán)。

在藥明康德外顯子測序中，如果用illumina的捕獲試劑盒Duplication的比例約為10%，如果用Nimblegen的捕獲試劑盒Duplication的比例波動較大，在5~50%范圍 ，平均為30%。

在RNA-seq中，Duplication的比例約為40%。RNA-seq中，因為高豐度的mRNA集中在幾個基因上，集中度很高，所以Duplication的比例也就高。

測序的插入片段一般是多長？

測序的插入片段一般是100bp到600bp.

因為Hiseq測序過程中有一個橋式PCR的過程。如果插入片段過長，測橋式PCR產(chǎn)生的Cluster就會太大，而且光強也會減弱。所以插入片段的長度是有限制的。

PhiX文庫有什么用？

PhiX文庫是一種用病毒基因組做的文庫。其基因序列已精確知曉，GC比例約為40%，與人類、哺乳類的基因組的GC比例接近。其基因序列又與人類的基因序列相去甚遠(yuǎn)，在與哺乳類基因組一些測序時，可以輕松地通過基因序列比對而將之去除。

在測四種堿基不平衡（A、G、C、T四種堿基的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)偏離25%）的樣本時，可以加入大量的PhiX文庫，以部分抵消樣本的不平衡性。例如ChIPed DNA測序，或者亞硫酸氫鹽處理過的DNA文庫，或者擴增子測序（PCR樣測序），都可以加入PhiX，以部分彌補堿基不平衡性。

也可以少量地加入樣本，以作為control library來驗證測序質(zhì)量。

Hiseq和Miseq有什么差別？

Hiseq 2000的測序數(shù)據(jù)產(chǎn)量很高，一條Lane一次可以產(chǎn)生35G的Q30數(shù)據(jù)，一張Flowcell可以產(chǎn)生約300G的Q30數(shù)據(jù)。但是測一次序要9~11天的時間。所以較慢。

Hiseq 2500的一張PE 200 Flowcell可以給出60G的Q30數(shù)據(jù)，測序本身是一天時間，可以快速地以較高的通量給出高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)。

Miseq的測序數(shù)據(jù)產(chǎn)量低，一次可以產(chǎn)生1G~4G的數(shù)據(jù)。但是測長可以做到較長，目前可以測250*2。而且測序的速度非常快，一般一天就可以測完一張Flowcell。

Hiseq 2000和Hiseq 2500有什么差別？

儀器升級：

Hiseq 2500是Hiseq 2000的升級版。

其主要的改進點是：Hiseq 2500可以在快速、高通量兩種模式之間切換。高通量模式就是原來的Hiseq 2000的每張Flowcell有8個Lane的模式。

Hiseq 2500的快速模式，核心的改進是用2個Lane的Flowcell來測序，而且這種快速Flowcell的Lane比Hiseq 2000的Lane要短，數(shù)據(jù)產(chǎn)量也略低于高通量模式的2條Lane。

Hiseq 2500快速模式的試劑也有所改進。

速度提升：

Hiseq高通量模式，PE100，雙Flowcell，11天完成測序。數(shù)據(jù)量每Flowcell在270G PF data以上。

Hiseq快速模式，PE100，雙Flowcel，27小時完成測序。數(shù)據(jù)量每Flowcell在60G PF data以上。

數(shù)據(jù)質(zhì)量提升：

在快速模式下，Hiseq機器可以更快地拍完一個cycle的所有照片，也就是每個cycle的用時更少。SR50可以在1天內(nèi)走完，PE100可以在2天內(nèi)走完。這明顯比原來的3天（SR50）、11天（PE100）要快得多。

在速度加快的同時，還帶來質(zhì)量的提升。因為Hiseq測序過程中兩個主要的物質(zhì)：酶和熒光劑都是不穩(wěn)定的，或者說是在融化后（原來是冰凍的）隨時間延長而不斷降解的。為此Hiseq還為試劑準(zhǔn)備了4度冰格，以減慢其降解。原來的Hiseq 2000要走11天,現(xiàn)在2天完成，這帶來了明顯的測序質(zhì)量提升。

實測哺乳類動物的基因組DNA文庫， Q30比例可達85%以上，而且其中絕大部分是90%以上。

測序長度提升：

而且因為測序質(zhì)量的提升，也帶動測序長度的提升，目前Illumina官方支持的Hiseq 2500的測長是PE 2*150。

特別需要注意的，Illumina目前不直接提供PE150的試劑，客戶要用1*PE Cluster kit + 1*PE100 SBS kit + 2*SR50 SBS kit合起來，才能測PE150。

直接兼容更多文庫：

Hiseq 2500的快速模式試劑直接支持雙Index測序模式：

雙Index是指兩個接頭各有一個Index。這樣兩套Index排列組合，一個Lane里可以放更多的文庫。目前Illumina官方試劑是支持96個排列組合（ 12*8 = 96），這對充分利用Hiseq平臺巨大的測序數(shù)據(jù)產(chǎn)量有很大的幫助。原來的單Index是支持單側(cè)24種Index。

這與Hiseq PE100高通量模式標(biāo)準(zhǔn)PE100試劑只能測單Index。當(dāng)然，Hiseq2000b也可以測雙Index，但是用4個50 cycles SBS kit（每Kit保證58個cycles）拼起來（58*4=232），才可以保證有足夠的SBS試劑量，因為雙Index會實際需要216 cycles，這超過了200 cycle SBS試劑可以保證的cycle數(shù)。

儀器操作更方便：

Hiseq 2500快速模式可以直接在Hiseq儀上進行Cluster生成，這大大節(jié)約了先要在cBOT上生成Cluster，再要將Flowcell從cBOT上移到Hiseq的麻煩。

但是請注意，如果直接在Hiseq 2500上生成cluster，兩條Lane就只能上一種預(yù)混合文庫，而不能象原來的Hiseq 2000上那樣，兩條Lane物理分開。也就是說預(yù)混合文庫中的Index一定是要分得開的才行。

當(dāng)然，快速模式也可以還用cBOT生成cluster，但是那要另外買一個編號為CT-402-4001（全名：TruSeq? Rapid Duo cBot? Sample Loading Kit ）的試劑盒，這個試劑盒要好幾百美元。

試劑操作更方便 ：

Hiseq 2500快速模式的試劑是做成Master Mix的，也就是酶、Buffer、熒光dNTP等都預(yù)先混合好了，一大管，拿來一化凍就可以用，很方便。這與高通量模式試劑把酶、熒光dNTP分幾管的模式是不一樣的，高通量模式的試劑因為是分管的，所以使用之前還要人工再混合，這樣會多占用一點人工。

Hiseq 2500的兩個機位同時只能運行一種模式：

Hiseq 2500在一臺機器的兩個機位同時只能跑同一種模式，也就是要么都跑快速模式，要么都跑高通量模式，而不能一個機位跑快速模式，另一個機位同時跑高通量模式。

Illumina、Roche 454、Life Ion Torrent、SOLID和PacBio的高通量測序儀的優(yōu)缺點是什么？

Illumina的測序儀的數(shù)據(jù)產(chǎn)量高，數(shù)據(jù)質(zhì)量也是最高的。因為采用帶終止基團的熒光dNTP，所以在測Homopolyer（堿基同聚物，例如一串4個T：TTTT）等的時候，不會產(chǎn)生移碼錯讀。

Roche 454采用的是pyrosequencing的測序原理，通過水解DNA全成過程中所產(chǎn)生的焦磷，放出光，通過測這光來讀出序列。優(yōu)點是讀長最長。但是數(shù)據(jù)產(chǎn)量是最低的。

Ion Torrent，包括PGM和Proton，采用測量DNA合成過程中所釋放的氫離子引起的PH值的變化，來得到序列。優(yōu)點是速度最快，上機前約3~4天的時間，上機只要2~4個小時。

SOLID采用的是雜交，連接反應(yīng)，再測熒光的方法。因為雜交，所以速度慢，測長

較短。現(xiàn)在事實上已被淘汰。

PacBio是三代測序，也就是單分子測序。目前的情況是測序長度可以在1個KB以上，而且可以測出DNA序列的修飾情況。但是其缺點在于測序的準(zhǔn)確度很低，目前的測序準(zhǔn)確度只有每個堿基80~90%。另一方面通量較小，一次讀7萬條reads.

Illumina測序過程中，Multiplex index之間會有多少交叉的污染？

我們曾經(jīng)專門做過實驗，用4個親緣關(guān)系很遠(yuǎn)的物種的DNA，用4個index標(biāo)記，進行測序。測序之后進行基因組比對，發(fā)現(xiàn)每種index之內(nèi)會有0.02~0.03%的reads是別的物種的。也就是說因為Multiplex index引入的交叉污染，會以0.02%上下的比例存在。

這主要是由化學(xué)合成index oligo過程中的誤差引起的。根據(jù)我司的引物合成專家的經(jīng)驗，即使經(jīng)過HPLC的純化，oligo中還是會有0.5~1%甚至更高的錯的引物。現(xiàn)在的0.02%的污染率，已經(jīng)是很低了。

Hiseq和Miseq都可以做雙index測序嗎？

Miseq是天生就可以做雙index測序的。

Hiseq要升級到2500之后，才可以做雙index測序。而且，在測的時候要加一個試劑盒：Truseq Dual Index Sequencing Primer Box(下稱Dual Index Box)。

這個試劑盒只能用于一整個Hiseq 2000的Flowcell，也就是說無論一張Flowcell中有幾條Lane是雙index的，只要其中有一條Lane是雙index的，就需要用一個Dual Index Box.

我們對一個Dual Index Box， 收取1000元人民幣的費用。

Dual Index Box中主要是新加的測第2條Index的引物。

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