提起 LTR，相信很多人和我之前一樣都是熟悉又陌生的感覺，聽過或者接觸過卻未深入了解過。若您對 LTR 分析有興趣，卻苦于無從下手時，愿本文作為一個叩門磚，為您敲開 LTR 分析的大門。本篇從 LTR 的定義、分類、生物學意義、結(jié)構(gòu)特征、鑒定方法等方面層層遞進，帶您走進神奇的 LTR 世界。

1. LTR 與重復序列、轉(zhuǎn)座子的關系

LTR-RTs 是 Long terminal repeat-retrotransposons 的縮寫，中文名是長末端重復反轉(zhuǎn)座子。LTR-RTs 名字中既有重復、又有轉(zhuǎn)座子，那么它和重復序列、轉(zhuǎn)座子是什么關系呢？圖1 為您解答。

圖1??重復序列主要分類

重復序列：根據(jù)重復區(qū)域是否連續(xù)可分為串聯(lián)重復序列和散在重復序列（又名轉(zhuǎn)座子、轉(zhuǎn)座元件）兩大類，前者相連，后者不相連。

轉(zhuǎn)座元件(transposable elements, TEs) 又稱轉(zhuǎn)座子：指在基因組中能夠移動或復制，并可以整合到基因組新位點的一段 DNA 序列。根據(jù)轉(zhuǎn)座過程是否形成 RNA 中間體，轉(zhuǎn)座子可分為 DNA 轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是以 RNA 為媒介，伴有反轉(zhuǎn)錄過程，以復制-粘貼的方式在基因組的新位置產(chǎn)生一個新的拷貝。DNA 轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機制則是剪切-粘貼的形式。

LTR-RTs :是反轉(zhuǎn)座子中的一種，因其兩側(cè)存在長的末端重復而得名。不含長末端重復的反轉(zhuǎn)座子統(tǒng)稱 non-LTR-RTs，主要包含短散在重復(SINE)和長散在重復(LINE)。

2. LTR的分類

動植物基因組中存在大量轉(zhuǎn)座子，尤其是植物基因組中。LTR ?因其數(shù)量多且 LTR 長度巨大，在植物轉(zhuǎn)座子中具有較高的基因組含量。在玉米基因組中 LTR 占基因組含量高達 75% ，山蒼子基因組中 LTR 占比高達 47%，所以基因組 LTR 的鑒定尤為重要。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子根據(jù)轉(zhuǎn)座元件結(jié)構(gòu)的完整性和轉(zhuǎn)座特點可分為自主元件（編碼轉(zhuǎn)座酶）和非自主元件（自身不編碼轉(zhuǎn)座酶）。非自主轉(zhuǎn)座元件需在自主元件的協(xié)助下才能發(fā)生轉(zhuǎn)座。完整的 LTR-RTs 由兩端序列完全一致的末端重復、GAG（衣殼蛋白）和 POL 構(gòu)成，后生動物中含 ENV （包膜蛋白）。其中 POL 包含 AP（天冬氨酸酶）、INT（整合酶）、 RT（逆轉(zhuǎn)錄酶）和 RH（核糖核酸酶 H），是 LTR 能否自主轉(zhuǎn)座的關鍵蛋白。LTR 分類見圖 2，在高等植物中主要主要包括 Ty1/Copia和 Ty3/Gypsy 兩個超家族，二者差別在于 INT 的位置不同。

圖2??LTR?的分類[1]? ? ? P: 植物? M: 后生動物? F :真菌? O：其他??

3. LTR的生物學意義

不少研究表明活性 LTR 插入到關鍵基因內(nèi)或周邊會導致性狀改變。2019 年，發(fā)表在 Nature Communications 的《A high-quality apple genome assembly reveals the association of a retrotransposon and red fruit colour》文章中揭示蘋果紅皮表型形成與一個 LTR-RT 插入相關。MdMYB1 有 MdMYB11-1、MdMYB1-2 和 MdMYB1-3 三個等位基因，其中 MdMYB1-1 是控制蘋果果皮花青素合成的單一顯性基因。相較于黃蘋果基因組，在紅蘋果基因組的 MdMYB1-1 基因啟動子上游有一個 LTR-RT（命名為 redTE）插入，并經(jīng)過 PCR 驗證是紅蘋果中存在一段特異的序列（圖 3）。redTE 作為一種增強子，增強 MdMYB1-1 對光的敏感性，從而累計花青素，形成紅色表皮。

圖3? 蘋果紅皮 LTR-RT 插入[2]? ??

此外，LTR?的擴張和收縮也影響著基因組大小，文章小葉茶文獻《Mol Plant 項目文章 | 第一個茶樹染色體級別高質(zhì)量參考基因組發(fā)布》中，揭示小葉茶基因組中 LTR 的擴張尤其是非自主 LTR 的擴張是小葉茶基因組龐大的主要原因。

4. LTR-RTs 的結(jié)構(gòu)特征

典型的 LTR-RTs 的結(jié)構(gòu)有 5 個特征，其模式圖見 4-1，各特征意義如下：

圖 4-1? 典型 LTR 的結(jié)構(gòu)特征[3]??

(1) TSR（TSD）: 目標重復位點，是 4~6bp 的短的重復序列，在 5’LTR and 3’LTR 兩側(cè)，是轉(zhuǎn)座子插入的信號。

(2) 5’LTR and 3’LTR : ?LTR 兩端序列完全一致的末端重復， TG..CA box，完整的 LTR 均含有此結(jié)構(gòu)。LTR 長度一般在 85~5000bp。

(3) PBS(primer binding site) 引物結(jié)合位點: 在 5’LTR 的末端，可與一些 tRNA 3’ 末端互補結(jié)合的一段 18bp 左右的序列，是反轉(zhuǎn)錄的第一步。

(4)?蛋白區(qū)域: 長度通常在 1000~15000bp。

GAG：衣殼蛋白。

POL：包含4中酶，由AP（天冬氨酸酶）、IN（INT,整合酶）、RT（逆轉(zhuǎn)錄酶）、RH（核糖核酸酶），LTR 能否自主轉(zhuǎn)座的關鍵原因。

ENV：包膜蛋白，后生動物中存在。

(5) PPT：3’LTR 的起始位置短的富含嘌呤的序列，11~15bp。

LTR 在生物體內(nèi)歷經(jīng)成千上萬年的進化，發(fā)展出許多存在形式（圖 4-2）。我們通常將包含兩個相對完整的 LTRs 和已識別的 PPT 和 PBS 位點的元素，且兩側(cè)有 TSD 的 LTR 定義為 Intact LTR（A）。由于 LTR-RTs 兩端序列非常相似，LTR-RTs 內(nèi)可發(fā)生重組，導致內(nèi)部元件消失，形成 solo LTR（C），而 solo LTR 的數(shù)量表明了一個基因組中 LTR 去除的頻率和效率。此外 LTR 發(fā)生缺失、易位可形成截斷的 LTR（B）。LTR 也會經(jīng)常插入到其他 LTR 內(nèi)部區(qū)域，形成嵌套 LTR（D）。因存在這些突變機制，實際上完整的 LTR-RTs （A）只占基因組中所有 LTR-RT 相關序列的一小部分。

圖 4-2? LTR 存在形式[4]

5. LTR-RTs 鑒定方法

LTR-RT 的鑒定方法基本歸于三類：從頭預測、基于結(jié)構(gòu)預測、基于同源比對。LTR_STRUC[5]?是一款最早的從頭預測 LTR 的軟件，LTR_finder[3]?和 LTRharvest[6]?是目前為止鑒定 LTR 最敏感的程序，但假陽性依然很高。RepeatMasker[7]?基于數(shù)據(jù)庫，使用同源方法來預測 LTR，但不同物種 LTR 差異較大，構(gòu)建物種特有的 LTR 庫非常必要。在 2017 年密歇根州立大學園藝系的 Shujun Ou 團隊開發(fā) LTR_retriever[4]?平臺用于 LTR 的鑒定，文章發(fā)表在 Plant Physiology 上。這是一款整合軟件，以一個或多個 LTR 預測軟件鑒定 LTR 的結(jié)果作為輸入文件，通過不同模塊（圖 5-1）對 LTR 進行過濾和修正來對預測軟件的預測結(jié)果進行整合和調(diào)整，以得到非冗余精準且完整的物種特異 LTR 庫，再使用 RepeatMasker[7]?進行預測

圖 5-1??LTR_retriever 整合模塊[4]??

LTR_retriever 軟件從 sensitivity（敏感性）、specificity（特異性）、accuracy（準確性）、precision（精確度）四個維度對 LTR 鑒定結(jié)果進行評估，其具體意義見圖 5-2。以真實 LTR 和非 LTR 序列作為參考庫，使用軟件進行預測。對預測結(jié)果分為以下四類：

TP：真陽性，真實的 LTR，被準確預測出

FN：假陰性 ，真實的 LTR，未被準確預測出

TN：真陰性 ，非 LTR 序列未被預測當成 LTR

FP：假陰性，非 LTR 序列被當成 LTR

從下圖公式可知敏感性代表對真正 LTR 的檢出能力，特異性代表排除非 LTR 序列的能力，精確性代表正確檢出的能力，精確度代表檢出結(jié)果的真陽性率，精確度越高則表明結(jié)果越可靠。

圖 5-2? 鑒定結(jié)果評估指標[8]

使用 LTR_retriever 對現(xiàn)有軟件預測 LTR 結(jié)果進行，評估結(jié)果（圖 5-3）顯示 LTR_retriever 明顯優(yōu)于其他現(xiàn)有軟件，而 Shujun Ou 團隊在 2019 發(fā)表在 Genome Biology 上的有關轉(zhuǎn)座子注釋方法中推薦 LTR 的鑒定方法是使用以 LTR_finder 和 LTRharvest 軟件鑒定結(jié)果作為 LTR_retriever 的輸入文件[8]。

圖 5-3? 不同 LTR 鑒定方法比較[4]? ??

6. 諾禾致源為您定制專屬 LTR 分析方案

隨著三代測序技術的發(fā)展，借助于超長度長序列，重復序列的組裝將會越來越精確。人們對重復序列的研究會更加深入，而 LTR 因其特殊的生物學意義被格外關注。LTR 的鑒定是 LTR 相關分析的基礎，目前 LTR 分析方法尚無標準。表 6-1 是諾禾致源公司聯(lián)合發(fā)表的 LTR 分析相關文章列表。諾禾致源 LTR 分析流程中，先使用 LTR_finder 和 LTRharvest 對 LTR 進行鑒定，再利用 LTR_retriever 進行整合，構(gòu)建非冗余精準的物種特異 LTR 數(shù)據(jù)庫后使用同源預測方法進行注釋，再過濾掉假陽性，為您注釋出全面且精確的物種 LTR 序列，包括 intact LTR、solo LTR、LTR 相關序列，非典型 LTR 等。明確 LTR 含量在基因組中的占比，在染色體上的分布情況（圖 6-1）。

圖?6-1? LTR?在染色上分布[9]

根據(jù)物種 LTR 蛋白結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫，對 LTR-RT 進行結(jié)構(gòu)注釋和家族鑒定。LTR 分析很多，可根據(jù)物種 LTR 鑒定結(jié)果、生物學意義進行特殊分析，例如通過聚類分析，確定基因組中主要的 LTR 屬于何種家族（圖 6-2）；對 LTR 進行插入時間評估分析，探索 LTR 的進化動態(tài)（圖 6-3）；構(gòu)建特殊家族進化樹，研究某類 LTR 的進化等。此外，轉(zhuǎn)座子誘導的表觀遺傳變化經(jīng)常影響相鄰基因的差異表達并產(chǎn)生新的調(diào)控模式，例如前面所提的蘋果表皮顏色性狀文獻中檢測到紅蘋果 redTE 序列中有幾個區(qū)域明顯高度甲基化，這為 LTR 分析提供新的思路。

圖?6-2??LTR?家族鑒定[10]

圖?6-3??LTR?插入時間分析[11]??

表 6-1? 諾禾合作發(fā)表有關 LTR 分析高分合作文章?

參考文獻：

[1] Wicker T, Sabot F, Hua-Van A, et al. A unified classification system for eukaryotic transposable elements[J]. Nature Rev. Genet., 2007, 8(12):973-982.

[2]?Liyi Zhang,Jiang Hu,Jingjing Li,et al. A high-quality apple genome assembly reveals the association of a retrotransposon and red fruit colour.[J]. Nature Communications, 2019.

[3] Zhao Xu and Hao Wang. LTR_FINDER: an efficient tool for the prediction of full-length LTR retrotransposons[J]. Nucleic Acids Research, 2007, 35: W265–W268.

[4] Ou S , Jiang N . LTR_retriever: a highly accurate and sensitive program for identification of long terminal-repeat retrotransposons[J]. Plant Physiology, 2017:pp.01310.2017.

[5] Mccarthy E M , Mcdonald J F . LTR_STRUC: a novel search and identification program for LTR retrotransposons[J]. Bioinformatics, 2003, 19(3):362-367.

[6] David Ellinghaus, Stefan Kurtz and Ute Willhoeft. LTRharvest, an efficient and flexible software for de novo detection of LTR retrotransposons[J]. BMC Bioinformatics, 2008, 9:18.

[7] A.F.A. Smit, R. Hubley& P. Green RepeatMasker at http://www.repeatmasker.org .

[8] Ou S , Jiang N . Benchmarking transposable element annotation methods for creation of a streamlined, comprehensive pipeline.[J]. Genome Biology, 2019,20:275.

[9] Zhao G , Zou C , Li K , et al. The Aegilops tauschii genome reveals multiple impacts of transposons[J]. Nature Plants, 2017.

[10] Zhang Qun-Jie,Li Wei,Li Kui et al. The Chromosome-Level Reference Genome of Tea Tree Unveils Recent Bursts of Non-autonomous LTR Retrotransposons to Drive Genome Size Evolution.[J] .Mol Plant, 2020.

[11] Ticao Zhang, et al.. Genome of Crucihimalaya himalaica, a close relative of Arabidopsis, shows ecological adaptation to high altitude.[J].PNAS, 2019.