Tracking cell-type-specific temporal dynamics in human and mouse brains
關鍵詞： Neuron, TrackSci,scRNA-seq, scATAC-seq
原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867423009765#fig3
一句話簡介：通過開發名為TrackSci 的新技術，實現對人和小鼠大腦新生細胞的轉錄組和染色質可及性的表征。
圖形摘要:
背景：
（1） 成年哺乳動物大腦中會不斷生成新的神經元和膠質細胞，這是與記憶，學習，壓力相關的關鍵過程。目前普遍認為，神經元和少突膠質細胞的生成會隨著年齡的增長逐漸減少，但是下降到何種程度仍存在爭議；
（2）此前，通過Div-seq(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5480621/)，一種基于Edu標記和 FACs的單細胞轉錄組測序技術，已經描繪了成人大腦中祖細胞的基因表達特征，但是對其表觀遺傳狀態及其在衰老過程中的變化仍不清楚；因此，定量捕獲新生細胞并追蹤其轉錄組和染色質狀態變化的新方法對于了解發育，衰老，疾病狀態下的細胞群動態至關重要；
Single-cell combinatorial indexing VS 10x genomics single-cell sequencing
Single-cell combinatorial indexing: 通過組合索引組成細胞獨特的barcode
10x genomics: 基于油包水技術每個細胞與獨特的barcode反應
正文：
1. 基于TrackSci 獲取的哺乳動物大腦新生細胞的全局概覽
為了同時捕獲大腦新生細胞的轉錄組和染色質狀態變化，作者首先開發了一種名為TrackSci的新技術。這些技術受到了Div-seq的技術啟發。其主要的工作流程包括(Fig 1A)：
（1）用Edu標記小鼠；
（2）提取腦核，固定，然后通過點擊化學原位連接含疊氮化物的熒光基團，然后進行FACS 以富集Edu+ cells;
（3）通過兩輪索引，進一步分選Edu+ cells
（4） single-cell combinatorial index RNA & ATAC sequencing
Figure 1.
利用這項技術，作者對Young, Adult, Age, 5xFAD 小鼠進行了 sciATAC & RNA seq , 分別捕獲到了 14095 (RNA) 和 9316 (ATAC) 個細胞。然后對這些細胞數據進行了 Louvain 聚類和UMAP可視化(Fig 1B)?；谝延械募毎鹠arker (Fig C)，在RNA水平鑒定了 16個clusters, ATAC水平鑒定了 14個 clusters，其中有兩類細胞（室管膜細胞和脈絡從上皮細胞）可能因為豐度較低，僅在RNA數據集中檢測到。總體上，從兩個分子層面定義的細胞類型重疊得很好，并且詳細展示出了少突膠質細胞和神經元細胞的發生軌跡。
接著，作者觀察到了Edu+ cells 與 全腦細胞在細胞類型組成比例上的顯著差異。在全腦細胞中，成熟的神經元細胞（如小腦顆粒細胞）和分化的膠質細胞占主導地位，而前體細胞則很少。然而在Edu+ cells中，則富集到了大量的前體細胞，如少突膠質細胞OPCs, 嗅球神經母細胞等等。并且，他們還發現通過TrackSci流程進行的RNA/ATAC seq 在檢測細胞比例變化上有著非常高的一致性。
然后，他們又將Edu + /Edu- cells細胞與小鼠全腦細胞轉錄組圖譜進行了整合，發現Edu+ cells 形成橋接幾種分化成熟細胞的連續細胞分化軌跡，包括從少突膠質前體細胞（OPC）到成熟少突膠質細胞的分化軌跡，以及從嗅球神經母細胞到嗅球神經元的分化軌跡等，但是這些“橋” 細胞在原先的圖譜分析中是沒有被發現的（Fig S1R）。
2. 鑒定新生細胞細胞類型特異性的表觀狀態和TF 調節因子
接下來，作者就對新生細胞進行了差異表達和差異可及性分析，產生了5610個差異基因和 68556個差異可及性位點。其中 1744（31%）的DE genes 在相同的細胞類型中具有對應的差異可及性promoter。這些細胞類型特異性基因的表達和對應啟動子的染色質可及性展現出了良好的相關性（Fig 3A）。他們也檢測到了許多尚未被全面表征，但是細胞類型特異性很高的marker genes. 例如 Sox2 和Dcx (Fig S2B)。
然后，為了進一步探究塑造新生細胞轉錄組的表觀狀態，作者鑒定了cell marker genes 細胞類型特異性表達背后的順式調控元件。他們計算了88 個 pseudo-cells （按 k 均值聚類分組, 具有相鄰綜合 UMAP 坐標的細胞子集 -- 類似于 meta-cell） 之間基因表達和鄰近位點可及性之間的相關性。在FDR=0.05的標準下，鑒定了 15485個基因和遠端位點以及2832個基因和啟動子之間的正連接(Fig 3B)。根據計算結果，大多數基因只與少數遠端元件之間存在連接，中位數是每個基因和2個遠端元件之間存在連接，例如Dlx2 基因。也有少數基因和多個遠端位點之間存在連接，如 Olig2 基因（Fig 3C）。其中 Dlx2的基因表達，啟動子可及性，連接的遠端位點可及性都是在富集在神經元發生軌跡中，Olig2 基因都是富集在少突膠質細胞發生軌跡中。
接著，作者又計算了轉錄因子表達和motif可及性之間的相關性，然后鑒定了70 個細胞類型特異性的TF調節因子，包括19 個潛在的抑制因子和 51個潛在的激活因子(Fig 3D)。像Dlx2 的表達與motif的可及性呈正相關，而Olig2 的表達與motif可及性呈負相關（Fig 3F）。通過這種方法，作者發現了許多之間研究相對較少的細胞類型特異性轉錄因子，如Zfx, Pou6f1, Hmbox1等。
3. 成年階段細胞類型特異性增殖速率的全球視角
在表征了新生細胞的轉錄組和表觀狀態之后，作者開始比較不同條件下細胞的增殖變化情況。通過比較年輕，成年，衰老和AD小鼠大腦中Edu+ cells的比例變化，他們發現大腦細胞的增殖隨著年齡的增長而急劇下降(Fig 4A)。接著，他們從細胞類型層面量化了不同細胞類型增殖率在不同時期的變化倍數，檢測到了各位祖細胞對衰老的高度異質性反應。例如在衰老小鼠中，齒狀回神經母細胞的比例只有成年小鼠的1/18（Fig 4C）， 而血管細胞增殖僅受到輕微的影響。此外，小膠質細胞和免疫細胞可能由于衰老大腦中炎癥反應的增加，它們的細胞增殖能力有所上升，在整體的細胞組成比例中也大幅增加 (Fig 4C,D)。
為了進一步驗證大腦衰老過程中細胞類型特異性的動態，作者將TrackSci 收集的細胞與 小鼠全腦細胞圖譜進行了整合和比較分析，整合分析促進了稀有祖細胞的鑒定，例如神經祖細胞（NPC），少突膠質細胞前體細胞（COP）。 這兩類細胞在跨數據集中都展現出了隨著衰老，細胞比例顯著下降的趨勢。而小膠質細胞在衰老小鼠表現出增殖增加。
此外，作者研究了衰老對祖細胞自我更新和分化潛能的影響，所謂的自我更新能力是新生成前體細胞與總前體細胞的比例，分化潛能是新產生的分化成熟的細胞和分化軌跡中所有新生成細胞的比例。結果顯示，細胞的自我更新和分化潛能都隨著衰老顯著下降。
4. 衰老對成年小鼠神經發生的影響
接著，作者開始探究衰老對成年小鼠神經元和少突膠質細胞的發生的影響，并描繪潛在的轉錄和表觀遺傳調控程序。首先，他們通過RNA 速率分析確定了三條神經元分化的主要路徑，即分化為齒狀回母細胞，星型膠質細胞和嗅球神經母細胞的三條途徑（Fig 5A）。他們收集了標記1，3，9day的樣本進行了TrackSci分析，觀察到隨著時間的延長，更多分化成熟的細胞逐漸累積(Fig 5B)。通過差異表達分析，他們鑒定了隨著齒狀回和嗅球發育軌跡差異表達的基因。此外，他們也鑒定了在發育過程發生動態變化的可及性位點，并從中鑒定出了與神經發生密切相關的關鍵轉錄因子，20 TFs 與DG neurongenesis 相關， 283 TFs與 OB neurongenesis相關。這些轉錄因子的基因表達與motif（結合基序）的染色質可及性呈現出了很高的相關性（Fig 5C）。包括一些正調節因子如 Neurod1,Neurod2 ，以及抑制因子如Myt1l。
為了探究衰老對成年小鼠神經發生的影響，他們比較了在不同條件下，通過trackSci 轉錄組測序捕獲到的，沿著神經發生軌跡的細胞密度。與先前細胞水平的分析相一致（Fig 4C），他們觀察到了隨著衰老，DGNB, NPC細胞密度的顯著下降（Fig 5D）。 接著，他們使用milo 算法進行差異豐度比較分析，來鑒定隨著衰老而顯著改變的細胞鄰域。然后，他們發現14個細胞鄰域表現出了顯著的下降，且主要來源于NPC，由此可見，衰老主要是通過下調祖細胞的增殖率來影響神經發生（Fig 5E）。
為了進一步探究NPC年齡依賴性變化的分子機制，作者又對年輕，成年和衰老小鼠的NPC細胞進行了差異表達分析，鑒定了30個隨著時間推移顯示出一致變化的基因，這些基因的表達和啟動子的染色質可及性變化也是相符合的（Fig 5F），例如Nrg1 , Nrg3 兩個神經營養因子，有報道稱體內給予這兩個因子可以促進神經元生成。
另外，作者也通過分析已經發表的實驗數據進行了驗證。該數據集采用了一種全基因組CRISPR 掃描的方法，可以通過定量基因特異性的sgRNA來系統評估基因在神經發生過程中的作用（Fig 5G) ^1。
1 The logic is that if the knockout of a gene results in a disadvantage for cell activation and proliferation, there will be fewer cells with that gene knocked out, leading to a lower enrichment of the corresponding sgRNA. Conversely, if knocking out a gene gives an advantage to activation and proliferation, cells with that gene knocked out will be more abundant, resulting in higher enrichment of the corresponding sgRNA.
他們比較了在此次研究中鑒定的衰老下調基因與隨機挑選基因的sgRNA富集程度，發現這些衰老下調基因的富集程度顯著低于對照組，因此，這一結果提示了這些基因的敲除會導致NPC的增殖受損。同樣，他們也比較了在2021年已發表研究中通過CRISPR篩選的敲除后最可能導致神經發生損傷的基因在本次研究數據集中表達情況，發現這些基因都是隨著衰老而表達下降（Fig 5H）。
5. 衰老對少突膠質細胞生成的影響
接下來，作者又探究了衰老對少突膠質細胞生成的影響。他們挑選了少突膠質細胞進行擬時序和軌跡推斷分析，產生了一條簡單的發育軌跡。并通過在Edu標記后第1天，第3天，第9天收樣測序和細胞密度分析，驗證了推斷的發育軌跡。
同樣的，他們又沿著發育軌跡進行了差異表達和差異可及性分析，鑒定了8443個差異表達基因和15164個差異可及性位點。通過計算TF和motif可及性之間的相關性，他們又從中挑選出了97個TF表達和motif可及性高度相關的組合。其中包括一些已知的少突膠質細胞發生相關調節因子，如Sox5,也包括一些尚未表征的新轉錄因子和潛在的抑制子。
然后，他們分析了不同條件下，少突膠質細胞發育軌跡上的細胞密度變化，并進行了與之前類似的細胞豐度差異分析，發現衰老時主要是COP（定型少突膠質前體細胞）數目下降，而早期的OPC（少突膠質祖細胞）變化并不顯著（Fig 6D,6E）。這一觀察與作者的一項配套研究和先前的報告中發現的衰老時新形成的少突膠質細胞耗竭相一致。
接著，為了進一步分析這一現象背后的分子機制，他們鑒定了隨著衰老OPC中表達發生顯著變化的基因。其中大部分的DE基因都得到基因表達水平和啟動子可及性的雙重驗證。這些基因在功能上與細胞遷移，Ca2+通道，鞘磷脂代謝，還有細胞循環相關。
6. TrackSci 有助于識別老年人類大腦中的稀有祖細胞
接下來，作者試圖研究TrackSci 數據集能否促進老年人類大腦中稀有祖細胞類型的鑒定。他們首先對 6個個體共29個老年人腦樣本進行了單核RNA-seq，總共獲得了798434個細胞的測序數據。由于衰老人腦中增殖細胞的稀有性，直接從原始的圖譜中通過無監督聚類來鑒定循環細胞和分化細胞是非常困難的（Fig S7C）。
因此，作者將本研究中獲得的小鼠 TrackSci 數據與人類大腦數據進行了整合，盡管存在跨物種的差異，整合的數據還是幫助鑒定了老年人類大腦中的罕見增殖細胞群。例如，他們鑒定了一群在人類與小鼠Edu+ cells重疊的循環細胞（Fig 7A），進一步的亞聚類分析又將這群細胞分成了 循環膠質細胞，Cycle OPC，Erythroblasts-Cycle （循環紅細胞），這些細胞當中也表達典型的細胞周期相關基因（Fig 7B,7C）。
此外，整合分析還促進了典型細胞分化軌跡的鑒定。例如，在人類大腦數據中也鑒定到了連接OPC和成熟少突膠質細胞的COP。為了進一步探究少突膠質細胞生成過程中物種間保守的調控程序，他們整合小鼠和人類的數據，構建了一條平滑的細胞分化軌跡（Fig 7D）。并沿著分化軌跡，鑒定了人類中5680 個顯著改變的基因，其中1162個基因在小鼠和人類當中是共享。其中包括一些其中報道了參與少突膠質細胞發生的關鍵調節因子，如TCF7L1,TCF7L2。同時，他們也鑒定了物種間特異的調控基因，發現人類特異性的基因在功能與核糖體發生相關，小鼠特異性的基因主要和miRNA的處理和 mRNA 3' end的處理相關(Fig 7E,7F)。
此外，他們也探究了少突膠質細胞發生在不同腦區之間的差異，發現所有小腦樣本中的COP都是有所減少的(Fig 7G)。為了探索更深入的分子機制，他們進行了跨腦區的差異表達分析，分別鑒定了OPC, COP和OLG（少突膠質細胞）的區域差異基因，發現 45個OPC region specific genes中有 40 個是在小腦當中高度富集的。由此可見，小腦當中的OPCs 可能與其他區域的OPCs有著不一樣的分子狀態(Fig 7F,7H)。
Discussion
- 開發了一種能夠表征體內前體細胞的異質性和動態的新型測序方法 – TrackSci ;
- 基于TrackSci 表征了小鼠不同年齡階段的大腦前體細胞的轉錄組和染色質狀態；
- 揭示了衰老相關的細胞類型特異性增殖和分化能力的改變；
- 展示了TrackSci 數據集作為跨物種罕見增殖或分化細胞鑒定的錨的能力。
