材料
RPMI-5 或DMEM-5 完全培養基
新鮮分離的小鼠器官: ≤6 周齡的小鼠胸腺；6 周至6 個月齡的小鼠脾臟和淋巴結
60mmX15mm 培養皿
剪刀和鑷子（保存在70 ％乙醇的燒杯中）
裝有19G 針頭的6ml 注射器
200μm 尼龍濾網
步驟
?將新鮮分離的器官放入盛有3ml RPMT-5 或DMEM-5 完全培養基的60mmX15mm培養皿（每種器官一個培養皿）中， 用剪刀將器官剪碎。
用6ml 注射器的活塞將組織塊向培養皿底面用力擠壓直到僅剩纖維組織。
用裝有19G 針頭的6ml 注射器將組織懸液反復抽吸數次，以進一步粉碎組織團塊。
將細胞懸液通過200μm 尼龍濾網濾入離心管中。用約4ml 完全培養基洗一次培養皿，如需要則重復一次，之后將洗液通過濾網加入離心管中。
在離心機中以1000r/min (200g) 離心10min 后棄上清 。用20ml 完全培養基將沉淀重懸后離心，再以適量培養基重懸以便計數 。
如細胞不能立即處理，最好的保持細胞活力的辦法是將細胞懸液置于冰塊中。這種處理也能減少因細胞貼壁引起的細胞損失 。
如何去除脾臟細胞懸液中的紅細胞？
脾臟細胞懸液在進行淋巴細胞計數之前最好先去除紅細胞(RBC) 。胸腺和淋巴細胞懸液則不必去除紅細胞。脾臟細胞的亞群分離也需先去除紅細胞。
附加材料
ACK 裂解緩沖液
步驟
每個脾臟用約5ml 裂解緩沖液懸浮脾臟細胞；一個12ml 試管可用于裂解一個或兩個脾臟，也可以用50ml 離心管裂解更多的脾臟。
室溫孵育5min ，間以搖動。
加入洗液直至裝滿容器，在低速離心機上以200g 離心10min 后棄上清。再洗沉淀一次并以適量培養基重懸以便下一步操作（如去除死細胞、細胞計數或者細胞分離）。
一步梯度法去除死細胞
下面介紹的方法，其基本原理是基于活細胞（密度較小）和死細胞（密度較大）密度不同，從而有助于將活的淋巴細胞與紅細胞分離。
附加材料
高密度溶液：Ficoll-Paque (Ficoll 和泛影酸鈉；Pharmacia LKB) 或Lympholyte-M(Cedarlane)
12ml 或50ml 聚丙烯離心管（比聚苯乙烯離心管好）
注：Ficoll-Paque 和Lympholyte-M 的密度與溫度有關；該方法中所采用的以及其他商品化的高密度溶液適合在室溫中使用。因此應注意使細胞懸液、離心和高密度溶液控制在室溫。否則會因活細胞沉入離心管底導致在密度界面上損失活細胞。
步驟
用RPMI-5 完全培養基混懸細胞， 分裝到離心管中使其細胞數達到 0. 5X10^8~ 1 X10^8個細胞／2ml (12ml 離心管）或 1X 10^8~ 5 X 10^8個細胞／5 ml (50ml 離心管）。
用移液器吸取3ml （使用12ml 離心管時）或5ml （使用50ml 離心管時）高密度溶液， 將槍頭伸到離心管底，緩慢將高密度溶液加入細胞懸液下方。
室溫， 800g 離心15min。為了取得好的分離效果，最好將離心機的”brake” 開關關掉。
使用5ml 移液器，沿高密度層表面緩慢移動移液器槍頭， 吸入漂浮在高密度層上方的活細胞， 盡量少收集高密度溶液。將活細胞移入另一管中。
加入RPMI-5 完全培養基（少量細胞加入10ml , 細胞量較多時加入40ml) ，室溫，200g 離心10min。重復一次。
以適量培養基混懸細胞以便進行下一步操作。
