相信學習生信的小伙伴不難發現，在定量的時候大多的文章或者公司的結果都有這幾種定量的方式：FPKM（RPKM），TPM，CPM(RPM)還有count等等，這些究竟該如何使用，如何相互轉換，該用哪個？今天就和大家談談這個問題。
一、基礎知識
1. count
什么是count呢？實際上count就是原始序列比對到參考基因組上后，對應的基因有多少條reads命中到這個基因。是后續一切其它歸一化方法的基礎
適用范圍：通常count可以用于后續的DESeq2，edgeR等軟件進行差異分析，因為他們會對count進行另一種歸一化的方法——TMM后，默認使用負二項分布檢驗進行差異分析。
2.FPKM/RPKM
FPKM和RPKM分別對應Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments(每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的fragments)和Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads (每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的reads)，兩者的計算方法是一致的，只是應用的場景有所不同，通常前者用于雙端測序，后者用于單端測序，其余的內涵是一致的。
FPKM的計算方法如下圖，C為比對到基因的fragments數（count），N為比對到參考基因的總fragments數，L為該基因的有效長度。FPKM的初衷是為了能消除基因長度和測序量差異對計算基因表達的影響。
3.TPM
TPM代表Transcripts Per Kilobase of exon model per Million mapped reads (每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的Transcripts)是FPKM的一種改進算法，如果數學敏感的讀者應該會發現在FPKM的公式中，當比較同一個基因時，除了他們的C可能不同，測序總量帶來的N同樣的是不同的，兩個變量都不同的情況進行比較是可笑的，所以TPM的作者認為FPKM不適合在不同組樣本之間進行比較于是提出了TPM。
公式如下：
這里看著有點復雜，其實說白了就是先消除長度的影響，先把每個基因除去他們的長度，在求和然后用對一個基因走正常的FPKM的運算后除去剛才的求和的值后乘百萬。這樣的好處就使得剛才N不等的問題消除掉了，理論上就更適合不同組的樣本之間的比較了。
適用范圍：同FPKM，同時也可以粗略的比較不同組的基因的表達量（不推薦！）
4.CPM/RPM
這里這里的CPM或者RPM(read counts per million) ，其實就是不考慮長度不考慮長度直接把count除總count的N后乘百萬就完事了，很多公司很坑爹的因為miRNA的長度基本相同不考慮后直接把CPM寫成TPM，帶來了嚴重的誤導！
適用范圍：很難評估有效基因長度或基因長度基本相當的組學，如circRNA-seq、ChIP-seq、CUT&Tag、ATAC、MeRIP-seq等。
二、幾種歸一化方法的比較
看了上述的幾種歸一化方法，是否會讓你覺得TPM是一種完美的歸一化方法，其實非也，2020年的一個研究結果如下：
圖中y軸代表的歸一化方法的排名，可以看到TMM法基本吊打全局，和TMM相比其它方法都談不上優秀，看似很牛的TPM中位數還不如FPKM！
關于TMM歸一化算法和優勢感興趣的我們留一期單獨談談。
三、count轉FPKM、TPM
這里首先引入一個概念，上面談到的基因長度都是指有效基因長度，通常認為有效基因長度等于所有非冗余的外顯子的長度總和。明白了這一點我們就可以計算FPKM/TPM了，以R為例代碼如下：
首先，得到用htseq等工具或者TCGA下載到的count文件，以及對應物種的gtf文件（Ensembl下載），讀到R中，這里以hg38.gtf和count.tsv為例子
library(tidyverse)
#讀gtf文件，計算所有外顯子的長度
gtf <- read_tsv("hg38.gtf", comment="#", col_names=c('chr','source','type','start','end','score','strand','phase','attributes')) %>% filter(type=='exon') %>% mutate(len = end - start + 1) %>% select(start, end, attributes,len)
#計算基因的非冗余外顯子的長度，即獲得有效基因長度
gtf$attributes %>% str_extract(., "gene_id \"[\\w|\\.]+") %>% str_remove(., "gene_id \"") -> gtf$gene_id
gtf %>% select(start, end, gene_id, len) %>% distinct(start,end,gene_id, .keep_all = T) %>% select(gene_id,len) %>% group_by(gene_id) %>% summarise(est_len=sum(len)) -> gtf
#讀取count的表達量矩陣，列名為gene_id和count，其中gene_id是和gtf文件一致的，然后和剛才計算得到的有效基因長度合并
expmat <- read_tsv(count.tsv) %>% inner_join(gtf , by = 'gene_id' ) %>% drop_na()
#各種轉換的方法
countToTpm <- function(counts, effLen)
{
rate <- log(counts) - log(effLen)
denom <- log(sum(exp(rate)))
exp(rate - denom + log(1e6))
}
countToFpkm <- function(counts, effLen)
{
N <- sum(counts)
exp( log(counts) + log(1e9) - log(effLen) - log(N) )
}
fpkmToTpm <- function(fpkm)
{
exp(log(fpkm) - log(sum(fpkm)) + log(1e6))
}
countToCPM <- function( counts)
{
N <- sum(counts)
exp( log(counts) + log(1e6) - log(N) )
}
expmat %>%
mutate( FPKM = countToFpkm(.$count, .$est_len) ) %>% #轉FPKM
mutate( TPM = countToTpm(.$count, .$est_len) ) %>% #轉TPM
mutate( CPM = countToCPM(.$count) ) %>% #轉CPM
select(-est_len) %>% write_tsv("out.xls") #輸出結果
