代謝組學(xué)是基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的下游補(bǔ)充，提供生物系統(tǒng)生理狀態(tài)的總體評(píng)估。它代表了遺傳調(diào)節(jié)的終點(diǎn)及其對(duì)細(xì)胞中酶活性和內(nèi)源性生化反應(yīng)變化的影響。結(jié)合特征選擇、模式識(shí)別和多元數(shù)據(jù)分析方法，代謝組學(xué)分析旨在提供血液、尿液、組織或細(xì)胞中代謝物水平變化的綜合評(píng)估。

** 細(xì)胞樣本**

細(xì)胞樣本是代謝組學(xué)分析的重要樣本，細(xì)胞作為生物代謝的第一場(chǎng)所，在代謝組學(xué)分析中具有重要的研究意義。近年來，在眾多醫(yī)學(xué)、動(dòng)植物生理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究中，如疾病的標(biāo)志物的識(shí)別和檢測(cè)等，應(yīng)用于細(xì)胞樣本的代謝組學(xué)起到了重要的工具作用。

** 基于質(zhì)譜的細(xì)胞樣本研究**

基于超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的非靶向代謝組學(xué)分析流程一般包括：樣品的收集和預(yù)處理、代謝物提取、LC-MS全掃描檢測(cè)、數(shù)據(jù)預(yù)處理、統(tǒng)計(jì)分析及差異物結(jié)構(gòu)鑒定。其中第一步，樣品的收集和重復(fù)設(shè)置尤為重要，直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及數(shù)據(jù)分析。

代謝組學(xué)方法已廣泛用于動(dòng)物和植物組織、酵母和細(xì)菌，針對(duì)不同的組織和細(xì)胞類型開發(fā)了不同的樣品收集技術(shù)。

與其他樣本不同的是，細(xì)胞樣本收集后，需要馬上進(jìn)行淬滅過程，即快速的使細(xì)胞內(nèi)的酶失活，從而終止細(xì)胞內(nèi)代謝物的變化。細(xì)胞樣本的收集過程中，可以使用液氮進(jìn)行快速淬滅，但不能將液氮直接倒入細(xì)胞，這樣會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜直接破碎，使其內(nèi)容物直接流出，影響后期對(duì)細(xì)胞內(nèi)代謝物的分析。

[圖片上傳失敗...(image-d49b68-1638414302597)]

Sellick等人（2011）對(duì)細(xì)胞的代謝物提取過程進(jìn)行了優(yōu)化和驗(yàn)證，并評(píng)估了淬滅過程對(duì)代謝物的提取效果，過程中代謝物的泄漏情況，前處理過程中去除污染雜質(zhì)的效果以及樣品質(zhì)譜分析結(jié)果。以下是細(xì)胞樣本的收集及細(xì)胞培養(yǎng)液上清收集的科學(xué)方式，請(qǐng)各位老師查收@科研人

1、細(xì)胞收集

收集步驟：

針對(duì)懸浮細(xì)胞、貼壁細(xì)胞等來自培養(yǎng)基培育的細(xì)胞，需要考慮到培養(yǎng)基和細(xì)胞體的分離，且要考慮到收集完成后細(xì)胞內(nèi)部的代謝活動(dòng)是否繼續(xù)，基于這種因素，一般細(xì)胞樣本在收集過程中，需要增加淬滅這一步驟。

細(xì)胞樣品收集前采用細(xì)胞計(jì)數(shù)器或細(xì)胞計(jì)數(shù)系統(tǒng)計(jì)數(shù)，約5106~1108個(gè)細(xì)胞的量是符合代謝組學(xué)分析要求的。

貼壁細(xì)胞收集過程：

1.快速倒掉培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)皿倒置于吸水紙上吸干培養(yǎng)液。

2.加入4℃預(yù)冷的PBS反復(fù)沖洗2~3次（若用移液器加，則靠著培養(yǎng)皿壁加入，以免將細(xì)胞沖起）倒掉PBS。

3.用移液器吸盡殘余的PBS，將培養(yǎng)皿底部（外壁）接觸液氮，淬滅細(xì)胞（1*107個(gè)細(xì)胞為宜），

4.加入500微升預(yù)冷的甲醇-水（4：1，V/V），用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，用移液器轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中，

5.再向培養(yǎng)皿中加入500微升預(yù)冷的甲醇-水（4：1，V/V），將剩余的細(xì)胞盡量全部轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中，使用封口膜將離心管密封（也可淬滅細(xì)胞后不加入提取液直接刮下轉(zhuǎn)移細(xì)胞至離心管）-80度凍存。

注意：

（1）若加入提取液一定要用封口膜封嚴(yán)

（2）若做脂質(zhì)、脂質(zhì)擬靶向、靶向代謝等，不可按甲醇水（4:1）方法操作，應(yīng)淬滅細(xì)胞后不加入提取液直接用刮下轉(zhuǎn)移細(xì)胞至離心管

（3）液氮淬滅細(xì)胞時(shí)，請(qǐng)小心離心管質(zhì)量，防止離心管破碎導(dǎo)致樣本受損

（4）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)至同一時(shí)期的細(xì)胞，建議多準(zhǔn)備樣本，以備后續(xù)使用

（5）貼壁細(xì)胞收集時(shí)如遇培養(yǎng)皿較大，1mL試劑無法完全轉(zhuǎn)移，建議加入最大試劑體積不超過3mL

（6）貼壁細(xì)胞的收集也可使用胰酶消化后，低速離心，去掉培養(yǎng)液上清，再使用PBS溶液清洗1-2次，棄掉PBS上清溶液，將收集好的細(xì)胞沉淀液氮淬滅后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)

懸浮細(xì)胞收集過程：

1.連同培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到進(jìn)口的15 mL的離心管中，低速離心5 min（低于3000 rpm），使細(xì)胞沉淀于離心管的底部（1*107個(gè)細(xì)胞為宜）。

2.倒掉培養(yǎng)基（盡量倒干凈），用PBS反復(fù)沖洗2~3次。

3.標(biāo)記離心管，將離心管的尖端插入液氮中，淬滅細(xì)胞沉淀1 min，然后-80度凍存。

注意：

（1）操作盡量迅速，培養(yǎng)基盡量倒干凈，如有濾紙，建議用濾紙將殘留的培養(yǎng)基吸盡。

（2）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)至同一時(shí)期的細(xì)胞，建議多準(zhǔn)備樣本，以備后續(xù)使用。

保存介質(zhì)

保存介質(zhì)與此后的提取結(jié)果有較大關(guān)聯(lián)，細(xì)胞在儲(chǔ)運(yùn)過程中難免會(huì)發(fā)生凍融，可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大影響。如無必要，我們建議樣品棄掉上清和PBS后，直接將剩下的細(xì)胞沉淀送樣進(jìn)行分析，這樣做可以盡量避免由于介質(zhì)的原因?qū)е聦?shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)生偏差。如細(xì)胞必須使用介質(zhì)進(jìn)行保存，則建議您使用甲醇水混合溶液進(jìn)行保存，最佳比例為甲醇水溶液（"margin-top: 0px; margin-bottom: 0px; clear: both; box-sizing: border-box;">

注意：

細(xì)胞分離過程中，由于細(xì)胞脆弱，一些不當(dāng)操作會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞破碎，從而影響代謝組學(xué)分析過程，因此有如下注意事項(xiàng)

1.樣本收集過程中全程操作不宜過度劇烈，切勿渦旋震蕩、高速離心或超聲等，同時(shí)避免反復(fù)凍融，以保證細(xì)胞膜不會(huì)破損，減少代謝組學(xué)分析影響。

2.使用PBS清洗時(shí)，切勿沖走細(xì)胞，清洗充分后，盡量將PBS完全倒掉。

3.淬滅時(shí)注意控制條件和時(shí)間，一些哺乳動(dòng)物的細(xì)胞系不能接受-45℃以下的淬滅條件，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜破碎。

4.切勿將液氮直接倒入培養(yǎng)皿中淬滅，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞破碎，代謝物流出。

2、細(xì)胞培養(yǎng)液上清收集

收集步驟：

1.取細(xì)胞培養(yǎng)液約2mL，低速離心，將細(xì)胞沉淀分離。

2.取1mL（建議量，最少500μL）以上上清液，-80℃儲(chǔ)存樣本，足量干冰寄送樣本。

注意：

培養(yǎng)液上清由于其樣品屬性，一般情況下，樣本代謝物含量較低，且含鹽含糖量較高，分析難度較大，對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)方法均有較高要求，需要注意以下幾點(diǎn)：

1.確定需要進(jìn)行代謝組學(xué)分析后，請(qǐng)進(jìn)行售前聯(lián)系，提交培養(yǎng)基內(nèi)容物，以確定能否進(jìn)行代謝組學(xué)分析操作。（歡迎致電：17317724501咨詢）

2.樣本收集時(shí)，嚴(yán)格避免高速離心、劇烈晃動(dòng)、過高或過低溫度導(dǎo)致培養(yǎng)基中的細(xì)胞破碎。

3.收集后避免反復(fù)融凍，全程低溫儲(chǔ)運(yùn)，長(zhǎng)距離運(yùn)輸使用干冰，直至分析。