文獻鏈接：Challenges in neoantigen-directed therapeutics
發表期刊：Cancer cell
影響因子：31.7
發表時間：2023年1月
原文作者在期刊內總結了 “新生抗原靶向治療” 當下面臨的挑戰和潛在突破點，尤其生物信息學相關軟件匯總很詳細~
1. 腫瘤免疫治療的現狀
1.1 免疫檢查點抑制劑(ICI)不是萬能的
希望ICI單藥治療潛在的所有癌癥患者是不現實的。在一些NSCLC患者研究隊列中顯示納武利尤單抗對其治療并沒有明顯效果。Haslam等人的一項分析估計，符合ICI藥物治療條件的美國癌癥患者的比例為43%，而實際上只有12%的患者對該治療有反應。盡管PD-L1的表達仍被認為是預測ICI治療反應使用最廣泛的生物標志物，但Yarchoan等人進行的一項隊列研究顯示，在所有主要腫瘤類型的10,000個樣本中，只有15.2%的患者患有PDL1陽性腫瘤。
1.2 免疫細胞療法仍存在局限性
ACT療法領域中的CAR-T療法，已經在幾種血液腫瘤中表現出顯著療效并獲得FDA認可。但是CAR-T療法在實體瘤中的局限性可能歸因于對TAA的選擇而非TSA。同時，對于晚期癌癥患者免疫系統受到抑制，也是ACT療法無法在實體瘤患者中發揮重要作用的原因。此外，實體腫瘤表現出非常復雜的免疫抑制回路，這些都有利于腫瘤細胞躲避免疫攻擊。這種 腫瘤的異質性 可能是癌癥免疫療法在許多類型癌癥中失敗的主要原因。
腫瘤特異性抗原（TSA）vs 腫瘤相關抗原（TAA）：TSAs只在腫瘤細胞表達，通常為體細胞突變或腫瘤特異性基因表達或剪切模式。TAAs為在腫瘤細胞中顯著富集的特征抗原，不過該類抗原也可能表達在正常的細胞中（但是通常只在腫瘤細胞中高表達）。由于TAA屬于自身抗原并不容易激發免疫反應，藥物研發中也很少選擇此類抗原，避免其脫靶效應會損傷非病理性組織和細胞。
1.3 新生抗原靶向治療帶來希望
腫瘤突變負荷（tumor mutational burden, TMB）與腫瘤特異性突變肽的數量呈現正相關，與患者使用PD-1抑制劑有效反應呈正相關。也是最初推動人們用“新生抗原”控制腫瘤生長的啟發點。因此人們開始探索個性化免疫療法，旨在增加新抗原特異性T細胞數量。其中便包括腫瘤疫苗，或獲得性細胞治療（adoptive cell therapies, ACT）如TCR-T和CAR-T療法。
2. 聯合治療策略（新抗原驅動療法）
由于ICI單藥治療在不同癌癥類型中的抗腫瘤活性相對較低，人們開始嘗試各種聯合治療策略，其中基于新生抗原的免疫療法被廣泛關注。同時，縱向評估治療方法來揭示某些耐藥機制的潛在發展是非常有必要的，有利于臨床實驗高效調整治療方法。據觀察，在ICI治療下復發的腫瘤表現出不同于起始的新表位突變譜。
腫瘤的異質性：近年來，人們發現腫瘤免疫微環境對腫瘤進展和免疫治療反應預測至關重要。一些失敗的臨床結果在如今可以通過基因和免疫環境異質性來解釋。目前3種“免疫類型”被定義，immune inflamed, immune excluded, immune deserted。
2.1 inflamed tumors：新抗原驅動療法和ICIs
此類腫瘤存在大量免疫細胞浸潤，但腫瘤的免疫逃逸使得免疫細胞的活性受到抑制。考慮到新抗原可以作為激活免疫系統抗腫瘤的重要反應靶點，因而將靶向新抗原的治療與ICI結合可能具有重要的臨床價值。腫瘤疫苗可以誘發和增強廣泛的新抗原特異性T細胞水平，而ACT療法原則上可以傳遞大量的特異性T細胞而不需要體內擴增。無論以上哪種方式的腫瘤新生抗原T細胞，都能在腫瘤微環境中產生IFN-γ，它通常與腫瘤細胞上PD-L1表達上調呈現正相關，從而誘導效應T細胞的非活化狀態。多項臨床研究表明癌癥疫苗和ICI治療聯合存在好處，也有報道指出TIL-ACT方法聯合派木單抗有效治療乳腺癌患者。綜上所述，ICI治療確實能夠激活免疫抑制環境中的靶向新抗原的效應T細胞的腫瘤殺傷活性。
2.2 excluded tumors：新抗原驅動療法和抗血管生成療法
非免疫浸潤型腫瘤通常存在致密的間質結構，這會導致T細胞和其他抗腫瘤的免疫細胞無法浸潤。因此，新抗原誘導的T細胞或ICI療法都無法到達腫瘤部位發揮作用。這種情況下，將兩者與抗血管生成療法結合，針對血管化的方法誘導腫瘤組織的T細胞浸潤。不過，截止到目前仍然沒有觀察到有相關臨床III期的有益報道，但是，有多篇研究顯示，ICI治療聯合抗血管生成療法有望重新激活excluded tumor中的耗竭T細胞（尤其在腎細胞中）。
2.3 deserted tumors：新抗原驅動療法和ICD誘導療法
deserted tumors患者的免疫治療方法選擇有限，免疫原性細胞死亡療法（ICD）正是針對此類癥狀開發的一種療法。放療、化療和溶瘤病毒療法都可能導致免疫原性細胞死亡，導致不同的分子突然釋放，其中便包括癌癥抗原，受損的蛋白，受損的分子和促炎性細胞因子，從而激發免疫系統抗擊癌細胞。新抗原誘導的免疫療法同樣可以促進ICD的反應，因而與其聯合治療將會使得此類患者更加受益。細胞還原療法在手術前后都能夠縮小腫瘤體積或消除殘留的或轉移性癌細胞，還被發現可以用作原位疫苗。它可以減少抑制性免疫細胞的數量，同時提高疫苗的效力。最近有臨床I/II期研究表明，化療和治療性疫苗接種顯著延長了宮頸癌患者的生存率。僅使用化療的OS僅為10-13.3 months，而聯合治療將中值OS提高到16.1 months
3. 新抗原特異性反應鑒定
3.1 外周血的免疫評估
ELISPOT，多重免疫染色，抗原特異性主要組織相容性復合體多聚體現在被廣泛用于評估疫苗誘導的T細胞表型、功能和占比（體外或體外刺激后）。IFN-γ ELISPOT可以準確得測量單個疫苗多肽表位特異性T細胞的頻率，而激活標志物如 41BB和脫顆粒酶標志物CD107a的表達，可以評估疫苗誘導的T細胞的激活狀態和細胞毒性潛力。TCR-seq同樣可以評估T細胞克隆型的數量變化。不過，如果要對新抗原特異性T細胞免疫進行全面和深入的分析，往往需要大量的PBMC樣本。不過scTCR-seq和scRNA-seq使得研究者在單克隆水平上解析疫苗特異性T細胞反應稱為可能。能夠在高分辨率水平提供此類細胞的表型和功能信息。
3.2 腫瘤樣本的免疫評估
通過外周血了解循環T細胞反應，并且整合腫瘤TILs和其他免疫細胞的狀態對疫苗接種后的臨床研究非常重要，以此可以評估個性化腫瘤疫苗的效力。腫瘤組織的質量和數量一般都很局限，但是新技術的發展突破了這一限制。對于FFPE樣本，可以在空間水平，通過多重免疫組化和免疫熒光方法完整得表征腫瘤免疫浸潤特征。通過對配對的腫瘤穿刺樣本做scRNA-seq和scTCR-seq，評估疫苗治療前后腫瘤TILs中TCR克隆型的頻率，即可追蹤每種克隆型隨治療時間所產生的動態差異。scRNA-seq提供了關于攜帶單個TCR克隆型的T細胞的細胞狀態和功能的信息。并可以將腫瘤細胞、基質細胞、各類免疫細胞分成不同的子集，以疫苗接種前后為參照進行不同子集的對比分析。同時，這些不同細胞群在單細胞分辨率的空間分辨信息可以通過空間轉錄組的方法生成。
4. 生物信息學的挑戰
將新抗原從患者的整套腫瘤肽中分離出來不是一個簡單的工作，因為要考慮多種因素：如患者的HLA類型，腫瘤細胞的異質性，肽的內在加工特性等考慮在內。
新抗原預測框架（當前標準）
- step1: raw data前處理和HLA分型
- step2: reads比對和變異檢出
- step3: MHC結合和呈現的預測
- step4: 新抗原的有限排序和選擇
4.1 HLA分型
目前大多數pipeline集中于MHC I類預測，使用DNA測序數據作為輸入文件，盡管MHC II類的預測也很重要，但是關于此類分型的pipeline并沒有MHC I類多。同時，在很多軟件中，RNA-seq數據也可以被用于HLA-typing，但是與DNA-seq的數據相比準確率偏低。本篇文章中作者舉例了非常豐富的軟件信息，表1僅截取其中部分。
同時，HLA的等位基因丟失、異常突變和表達減少也會影響新抗原的呈遞從而造成腫瘤免疫逃逸。因此，在預測新抗原時，也需要考慮HLA基因的表達水平和突變情況。
4.2 read比對和突變檢出
reads比對常用的軟件如Burrows-Wheeler 和 STAR（分別用于DNA-seq和RNA-seq），腫瘤突變檢出軟件種類也非常多，大多聚焦于SNP、insertions、deletions(indels)，其中引起閱讀框移動的insertions 和 deletions通常比簡單的SNV傳遞更高和更多的免疫原性表位。但不得忽視的是，一些其他類型的腫瘤變異也會產生新抗原。
4.3 新抗原結合親和力和呈遞預測
腫瘤新抗原通過患者MHC復合物遞呈對激活T細胞免疫是至關重要的。現有的遞呈預測模型都是以突變蛋白為起始點，通過滑窗剪切的方式獲得適配MHC-I的8-11個氨基酸的k-mer peptides。這些肽鏈被輸入到預測模型中，根據機器學習的方法和訓練數據集被分類和評估。PickPocket 和 smmpmbec是兩款基于線性回歸模型工作的軟件，它們假設每個AA殘基對親和力的貢獻是線性相關的。但是最近又出現了更復雜的神經網絡模型，用來模擬肽序列和MHC復合物之間的結合效率，雖然它需要更豐富的數據集做支撐，但是這種模型評估總歸比線性回歸模型更好。
現在已經有兩個主要策略來解決HLA多樣性在抗原呈遞預測中的影響。
- 第一種策略：“等位基因特異性模型”，它是通過對單一HLA類型的數據集進行訓練獲得。不過現在僅對HLA類型可以匹配數據集的案例預測表現友好，如果對于訓練數據集中沒有的HLA類型，如罕見或新的HLA類型，仍然表現不佳。
- 第二種策略：“pan-HLA 模型”，它是由多種HLA類型的數據集訓練而成，通常用于跨HLA類型的新抗原結合預測，對一些沒有遇到過的HLA類型比較友好。
不過早期的算法大多通過體外肽-MHC 親和力分析獲得的數據進行訓練的，并沒有考慮一系列潛在的影響多肽遞呈的因素。比如多肽/MHC的結合穩定性，多肽的降解速率和胞內加工特性及運輸等。由于蛋白酶體降解和TAP介導的轉運不足，仍然會導致強的MHC結合物存在較低的遞呈效率，最終表現為肽遞呈預測假陽性水平的增加。
最近還有體內配體數據，通過pMHC-I免疫共沉淀后用MS分析獲得數據。這樣一來能夠更精確得從整體的水平觀察整個抗原肽呈遞過程。相關的預測軟件有NetMHCpan4, MHCflurry, EPIP, EDGE, MHCnuggets，前兩個表現出最高的準確性。
4.4 新抗原優先排序
預測工作流程需考慮的因素：MHC-I結合力，拷貝數狀態，HLA等位基因的表達水平，患者攜帶基因突變的表達情況，蛋白酶體降解，TAP介導的轉運因素。
最近，The tumor neoantigen selection alliance 發布了一系列特征和閾值，binding affinity（<34 nM）和基因表達水平（>33 TPM），疏水性和pMHC的穩定性（> 1.4h）同樣與新抗原遞呈有關。對于免疫原性的評估，免疫原的耐受性和同源性被認為是最關鍵的參數，因為有研究已經闡明~50%的真正能夠引起免疫原性的腫瘤表位通常與低同源性有關。
公開可用pipeline
現有的新抗原預測pipeline匯總如圖4。絕大多數的這些軟件并不直接分析WES/WGS的rawdata，相反得，它們更多得依賴于用戶提供突變列表。同時，大部分的pipeline支持RNA-seq數據的處理，用來尋找與患者高表達基因相關的新抗原。大多數的pipeline也實現了HLA的分型；大多數的pipeline都關注SNV和indels，也有個別軟件關注融合突變，可變剪切和內含子保留相關突變也能夠在部分pipeline中找到。而且所有的pipeline都實現了MHC-I binding分析
5. 新抗原預測--注意項
5.1 插入缺失、基因融合、可變剪切突變（計入在內）
尋找腫瘤中的免疫原性新抗原是非常具有挑戰性的，不僅要找到完整可靠的突變庫，同時還要通過突變庫盡可能預測到更多可靠的抗原肽。有研究學者指出，人類的免疫系統是可以自動消滅一些低TMB腫瘤中的新抗原癌細胞，因此一個好的新抗原預測算法是非常必要的。因此僅僅聚焦于SNV是不夠的，還應該更多得探索融合基因事件，轉座子活性和新的isoforms。腫瘤細胞中蛋白酶體降解相關功能蛋白的改變，可能會產生正常細胞中不會存在的蛋白質降解產物。在血液系統惡性腫瘤中，考慮到免疫球蛋白的多樣性和B細胞的高突變性，也可能會增加潛在的新抗原庫。
小片段的插入缺失、大片段的插入缺失、結構變異都有豐富的預測軟件。基因融合突變被多次報道與癌癥關聯，解決此類問題的軟件也非常多，但是大部分都有較高的假陽性，需要更多其他類型的數據或方法做輔助矯正。可變剪切發生在腫瘤細胞的概率比正常組織細胞高30%，因此此類異常蛋白也應該作為一個新抗原pool。可變剪切可以通過RNA-seq數據檢測，相關的軟件也有很多。
5.2 非典型突變（更有商機）
除了以上提及的突變驅動的腫瘤發生的情況，一些引起腫瘤細胞異常表達的事件也應該考慮在內。例如起始密碼子替代、非典型的閱讀框改變、長鏈非編碼RNA變異、5' 非編碼區的變異等。值得注意的是，此類非典型突變的蛋白質結構是沒有變化的，往往會在不同腫瘤類型患者中出現，因此對于腫瘤新抗原疫苗研發而言是非常有價值的靶標，因為它們具有更強的普適性（個體差異小），更容易商業化高效生產。
非外顯子突變預測需要整合測序數據和質譜配體數據集，但是質譜的方法仍然受高表達多肽的影響，MHC遞呈多肽的數量預測總會偏低。不過，現在也有一些其他的補救方法出現，如核糖體測序，使我們能夠驗證非典型基因表達來評估內含子區域的表達，并發現已知基因中的替代開放框。質譜可以用來揭示MHC復合物在體內呈現的腫瘤特異性翻譯后修飾和蛋白酶體產生的剪切肽。
5.3 腫瘤進化和瘤內異質性（考慮在內）
篩選具有代表性的新生抗原用于腫瘤疫苗是非常重要的一步。瘤內異質性是腫瘤進化的關鍵，僅僅對單例腫瘤樣本進行測序，以及僅針對一種新抗原的個性化治療是不夠的。因此，有必要對具有代表性的活檢樣本進行多區域測序，用來評估一個給定的新抗原是否由所有的腫瘤細胞表達。
通常而言，腫瘤的克隆進化通常通過拷貝數變異或VAF（變異等位基因頻率）來評估。但是VAF的數據結構又會受到拷貝數變異情況影響，因此很多VAF統計軟件的精確性都依賴于CNV檢測算法的可靠性。這些數據也可以通過單細胞測序來獲得，但是這類數據提供的信息不可避免地存在dropout或區域覆蓋率低的問題。
5.4 MHC-II表位（考慮在內）
早期的研究普遍認為CD8+ T通過MHC-I抗原復合物激發機體免疫反應是消滅體內腫瘤的主力軍。因為腫瘤組織細胞均表達MHC-I而僅存在少量的抗原呈遞細胞會有MHC-II的表達。不過，近期越來越多的研究表明，CD4+ T細胞也存在間接或直接的效應功能，僅僅MHC-I類抗原復合物只能誘導次優的抗腫瘤免疫反應。MHC-II參與調解的代謝通路相關研究驗證了這一特點，同時也促使了MHC-II結合肽作為腫瘤疫苗的工藝研究發展。不過，由于MHC-II分子是由高度多態的α鏈和β鏈組成的異二聚體糖蛋白，被研究的HLA基因數量遠多于MHC-I（6 vs 3）使得它的類型更加多變；同時，MHC-II復合體是一個開口式的凹槽，這使得其綁定的多肽長度和序列組成上具有更大的變化。 (13–25 AA for MHC-II, compared with 8–15 AA for MHC-I)
6. 免疫原性預測
免疫原性預測可以通過體外的方法如ELISPOT評估，體外免疫原性評估是一個重要的工具，因為超過90%的預測新抗原是非免疫原性的。現在雖然有一些新的方法涌現，但是仍然不盡如意。
in silico prediction的相關研究仍然是缺乏的，目前只有很少數量的抗原能夠引發免疫反應，我們可以通過優先排序來篩選較為可靠的預測精確的抗原。大多數的預測流程都是將新抗原與自然形態的自體蛋白做對比，他們認為序列上越是不相似，越容易被免疫系統識別。
除了抗原肽的前處理、MHC親和力預測之外，突變肽的氨基酸序列也是影響pMHC-TCR識別和激發免疫系統的重要因素。有許多研究表明，肽內突變的位置很重要，將這一特征整合到新抗原預測管道中，可以提高免疫原性新抗原候選基因的排名；其他研究也報道了免疫原性肽在TCR相互作用位點富集于疏水AA，以及AA的重量、大小和電荷在建立pMHC-TCR復合物中的重要性。這都表明對pMHC-TCR相互作用建模是可行的。目前也有非常多的軟件可以使用，但是除了氨基酸的序列，HLA分型以及TCR序列信息，一個好的算法應該還要包括翻譯后多肽的修飾特點，將多肽的結構信息整合入預測管道。現在已經陸續有算法將其引入了，但是他們的數據高度依賴已經闡明的TCR-pMHC復合物，例如通過晶體結構來模擬相互作用。因此，目前仍然缺乏高質量的數據來訓練算法，導致目前基于蛋白結構的預測工具性能不佳。但是，嵌入structure-based的預測工具總是優于sequence-trained models。
7. 新抗原的選擇
新抗原的優先排序是新抗原發現過程中的最后一步。我們通常會選出數百個高親和力的新抗原，同時還會將一些抗原子集與T細胞反應來觀察免疫原性。同時，也要加入一些在腫瘤組織中突變頻率偏低的新抗原（靶向單個顯性致癌基因會導致多個耐藥克隆的發展，而靶向多個新抗原則可能導致特定表位的突變比例下調，而其他表位持續存在）。必須選擇一組具有良好代表性的新抗原，覆蓋大多數癌細胞而不是全部，以防止免疫逃逸。
最終的新抗原庫的大小是另一個需要解決的關鍵問題。同時靶向多個表位將導致更廣泛和更強的免疫反應，同時限制腫瘤細胞生長。此外，在治療中，不正確的靶點選擇和錯誤識別的表位，以及新抗原特異性T細胞與非突變型抗原的交叉反應，可能不能正確的引導免疫系統對抗腫瘤。為了權衡這兩個因素，通常選擇多達20種新抗原用于免疫治療，最大限度地提高每個患者免疫原性新抗原的真陽性比例。但是最佳的所需新表位數量仍然是未知的。
腫瘤的異質性暗示著我們應該重新考慮臨床試驗的設計方式：很多臨床試驗的失敗歸因于次優的患者挑選和分組。直到最近，只有已經完成了標準護理治療的患者才可以被納入研究隊列。因為那些有高度晚期疾病的患者往往失去了治療的選擇，將他們納入研究隊列會嚴重削弱臨床實驗的努力。
basket trails：選擇擁有共同生物標志物的不同腫瘤類型患者用于單一治療
umbrella trails：根據單一腫瘤類型的分子亞型區分患者，并用匹配的靶向治療來治療每個亞組
adaptive platform trails：評估不同的治療組和共同的對照組（其中可以添加新的實驗組或放棄已被驗證無效的實驗組）
這些新的試驗平臺可以顯著提高效率，并提供一個更有效的方法，因為它們可以根據不同癌癥的亞型定制化得對目標進行研究
