前言
自身免疫性葡萄膜炎（autoimmune uveitis，AU）是眼科最常見的自身免疫性疾病（autoimmune disease，AD）之一，具有病因復雜、發病率高、致盲率高等特點。以往研究發現女性AU患者在妊娠期間被觀察到癥狀得到緩解，然而孕激素（PRG），作為生殖的關鍵激素，對AU的治療和調控機制尚不清楚。
2023年6月21日，中山大學中山眼科中心蘇文如教授團隊在Journal of Neuroinflammation（lF=9.3）雜志上發表了題為“Progesterone attenuates Th17-cell pathogenicity in autoimmune uveitis via Id2/Pim1 axis”的文章。研究者通過構建實驗性自身免疫性葡萄膜炎（Experimental autoimmune uveitis，EAU）動物模型，首次揭示PRG能用于治療葡萄膜炎的可行性，并通過分析CDLNs的scRNA-seq數據，探討了PRG對治療AU的潛在分子機制。
作者首先發現PRG能改善EAU模型小鼠的視網膜病變和炎癥浸潤。進一步通過單細胞測序數據分析發現，PRG可調節Th17/Treg失衡，逆轉Id2/Pim1軸、IL-23/ Th17/GM-CSF信號的傳導，減弱了Th17的致病性，進而減輕EAU的疾病進展。這項研究提供了PRG治療對EAU的免疫調節作用的全面單細胞圖譜，并闡述了可能的治療機制，為其治療自身免疫性疾病的應用提供了新的見解。
結果解讀
1.PRG治療減輕EAU癥狀和眼內炎癥
作者首先構建了小鼠EAU模型，這是AU常用的動物模型，可用于AU的發病機制研究。與EAU小鼠相比，PRG在臨床和病理學上改善了疾病體征并降低了炎癥評分（圖1a，b）。炎性細胞（尤其是病理性T細胞）在眼部的浸潤對于病理性損傷至關重要。隨后通過流式細胞術，作者發現PRG處理的小鼠中視網膜浸潤性CD 45+免疫細胞和CD 4 + T細胞的比例遠低于EAU小鼠中的比例（圖1c，d）。此外，眼部浸潤性IL-17 A+（Th 17）和IFN-γ +（Th 1）CD 4 + T細胞的水平也顯示出類似的趨勢（圖1 e、f）。
<figcaption style="margin: 5px 0px 0px; padding: 0px; outline: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; overflow-wrap: break-word !important; color: rgb(136, 136, 136); font-size: 14px; line-height: 1.5em; letter-spacing: 0em; text-align: center;">圖1 PRG治療減輕了EAU癥狀和眼內炎癥</figcaption>
2.PRG治療改變了EAU CDLN中的免疫細胞圖譜
CDLN中免疫細胞的激活對于眼內抗原的識別和呈遞，對AU患者病情的發生發展至關重要。因此，作者為了闡明PRG治療作用的潛在分子機制，從未處理的EAU模型小鼠和PRG處理的EAU模型小鼠的CDLN中提取出免疫細胞用于scRNA-seq分析（圖2a）。通過嚴格的數據質量控制后，作者共獲得了40，873個細胞（naive，12，586個細胞; EAU，13，307個細胞和PRG處理的EAU模型小鼠，14，980個細胞）用于下游分析。隨后，作者基于標記基因，鑒定出了12種主要的免疫細胞譜系，如下所示：BC、CD 4 + T細胞（CD 4）、CD 8 + T細胞（CD 8）、增殖T細胞（Pro-T）、γ δ T細胞（GDT）、T和B細胞（TBC）、NK細胞、漿細胞樣DC（PDC）、常規DC（CDC）、單核細胞（MONO）、巨噬細胞（MACRO）和中性粒細胞（NEU）（圖2b）。進一步發現，T細胞和BC在CDLN細胞中占主導地位，并且細胞生態系統由EAU和PRG重建（圖2c）。
為了鑒定與EAU和PRG治療相關的分子事件，在EAU模型小鼠和naive小鼠之間（命名為EAU-DEG）以及PRG治療小鼠和EAU小鼠之間（命名為PRG-DEG）進行了差異表達基因（DEG）分析。在EAU期間，炎癥基因（S100家族、AP-1家族）和自身免疫相關基因（Pim 1、Cxcr 4）上調，而與免疫調節相關的基因（Tgfbr 2和Foxp 1）下調（圖2d）。這樣的改變在PRG治療后逆轉。此外，PRG降低了與細胞活化相關的基因（Cd 69、Cd 28）的表達（圖2 e）。接下來，進行基因本體（GO）和通路分析以分析生物學意義。與細胞因子產生、細胞活化和IL-17途徑相關的富集過程在EAU期間顯著上調，而其通過PRG處理下調（圖2f、g）。接下來進行細胞亞群分析，在EAU和PRG處理期間，髓樣亞群顯示出比其他細胞類型更多的DEG（圖2h）。GO分析表明 CD 4中PRG下調的基因在IL-17信號傳導途徑、炎癥途徑和Th 17細胞分化中富集（圖2i）。在附加文件中，可以看到PRG對其他細胞亞群的影響。總的來說，PRG治療抑制了EAU小鼠中的幾種細胞特異性炎癥基因和通路。
PRG處理改變了EAU的免疫細胞譜
3.PRG逆轉EAU誘導的PRG相關通路失衡
接下來，作者進一步研究了PRG相關通路是否在EAU模型小鼠中發生改變。通過分析每個亞組中與PRG通路相關的基因的表達，作者發現Stat5b、Foxo1、Afp和Cav1主要在CD 4中表達，而大多數基因在髓樣細胞中高度表達，例如NEU中的AP-1家族的基因（圖S3 a）。此外，在EAU模型和PRG治療的EAU模型小鼠中，幾個基因發生了改變。Fos、Fosb和Ccl 2的表達在EAU模型小鼠中增加，并且在PRG治療后降低。值得注意的是，免疫調節基因（Prmt 2，Foxo 1）的相對低表達也被PRG逆轉（圖S3 b）。此外，作者還使用ELISA驗證了三組的血清PRG水平，發現該水平在EAU期間降低，而在PRG治療后升高（圖S3 c）。總的來說，EAU誘導PRG及其相關通路的失衡，而PRG治療可以恢復這種穩態。
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4.PRG對EAU誘導的基因表達和炎癥反應變化的逆轉
本節中作者還探討了PRG對EAU誘導的免疫變化的特異性調節作用。通過EAU-DEG和PRG-DEG的綜合比較分析，作者鑒定出了被PRG部分拯救的EAU-DEG，并且這些被稱為“rescue DEG”（圖3a）。富集分析表明，在EAU期間上調的基因在IL-17和IL-6途徑、細胞分化和活化中富集，并且它們的上調被PRG逆轉（圖3b）。此外，上調的拯救DEG在TGF-β途徑和與免疫調節功能相關的幾個過程中富集（圖3c），表明PRG可以拮抗EAU誘導的免疫調節功能障礙。接下來，探索了拯救DEG在細胞亞群中的細胞類型特異性。如玫瑰圖所示，CDC具有最多的救援DEG（圖3d）。值得注意的是，炎癥和自身免疫基因（Pim1，Cxcr4，AP-1家族）的拯救在超過6個細胞亞群中存在。此外，幾種免疫調節基因（Zfp36l1、Txnip、Tgfbr2）的拯救作用在超過四種細胞類型中存在（圖3e）。基于拯救DEG與EAU-DEG的比率進一步研究了PRG的拯救作用的細胞特異性（圖3f）。CD8、PDC、CD4和BC是具有最高比例的下調的救援DEG的四種細胞類型，相比之下，在CDC中具有最高的上調的拯救DEG比率（圖3f）。
作者進一步分析了這些細胞亞群中的救援DEG，在CD8中，EAU增加炎性基因的水平并降低免疫調節基因的表達，這被PRG逆轉（圖3g）。另外兩種具有高比例下調的救援DEG的細胞亞型，BC和CD4，是自身免疫應答和EAU發展的重要介質。BC中下調的救援DEG的GO分析表明，在EAU期間上調的基因在體液免疫應答和BC分化和活化中富集，并且這種表達的增加被PRG抑制（圖3 h）。接下來，將BCs細分為五個亞組，幼稚B細胞（NBCs），Isg15+幼稚B細胞（IBC），記憶B細胞（MBC），漿細胞（PC）和germin B細胞（GBC）。PRG處理逆轉了EAU誘導的IBC、PC和GBC的積累，它們是參與BC活化的三個關鍵子集（圖3 i）。如Venn圖所示，EAU和PRG的作用具有細胞類型特異性。在IBCs中，與抗體應答相關的基因（Jchain，Ighg1）的表達隨著EAU增加，而PRG處理后則減少。還鑒定了類似的亞型特異性拯救模式，包括與PC中的BC激活和GBC中的高遷移率族家族相關的基因。在MBC和PC共有的四種基因中，與AP-1家族和抗體應答相關的基因（Mzb1）的表達在EAU組中增加，而在PRG組中減少（圖3 j）。總之，這些數據表明，PRG治療改變了EAU的基因表達和炎癥反應。
5.PRG調節Th17/Treg失衡并增加Treg浸潤和抑制功能
CD 4 + T細胞活化和Th 17/Treg失衡在EAU發病中起重要作用，其中Treg是維持免疫穩態的關鍵因子。GO分析表明PRG可以抑制CD 4 + T細胞中的幾種EAU誘導的自身免疫相關途徑和過程，例如IL-17信號通路、Th 17分化、淋巴細胞活化和細胞因子產生（附加文件1：圖S4 a）。為了探索PRG對CD 4+亞群的影響，將這些細胞分為六個亞組（圖4a）。其中，PRG逆轉了EAU誘導的Th 17和Th 1細胞亞群的增加，并逆轉了Treg細胞的減少（圖4 b）。當分析這些子集中的EAU-DEG和PRG-DEG時，作者發現PRG對EAU組的作用比EAU對幼稚組的作用更明顯（圖4c）。Tregs具有最高比例的上調的救援DEG，表明PRG增加了約40%的下調的EAU DEG的表達（圖4 e）。就PRG的下調作用而言，Treg和Th17是受影響最強的在記憶和效應CD 4+亞群中的前兩種細胞類型（圖4 e）。這些結果表明PRG可以逆轉EAU過程中的CD4+ T細胞活化和Th 17/Treg失衡。對Treg亞群進行了詳細的分析，發現EAU降低了編碼轉錄因子（TF，包括Id3，Txnip，Foxp1，Foxp3，Bach 2）和受體（Tgfbr1，Tgfbr2，Ccr7）的幾個基因的表達，但PRG逆轉了這些基因的表達。
此外，作者還發現與EAU相比，PRG上調了幾種基因（Tgfb1、Il2ra、Tcf7、Socs 1、Socs 3）（圖4f、g）。這些基因與Tregs的分化和免疫調節功能密切相關。富集分析顯示上調的救援DEG中與TGF-β信號傳導和白細胞分化的負調節相關的途徑被富集（圖4 h）。綜上，PRG治療EAU后，可增加Treg相關功能分子的表達，改善Th 17/Treg細胞的平衡，這可能是PRG減輕EAU炎癥反應的重要機制。
6.PRG對EAU誘導的Th17細胞比例和功能因子增加的抑制
Th 17細胞是主要的CD 4 + T細胞亞群，在EAU的發展中發揮關鍵作用。在Th17細胞中的49種下調的救援DEG中，13種也存在于Treg中，包括參與Th 17功能的關鍵介質（Bhlhe40和Ccr2）（圖5a，b）。這些基因在記憶細胞和效應細胞中高度表達，尤其是Th17和Th1細胞。作者還鑒定了在Th17細胞中高度表達的幾種基因，包括介導CD4 + T細胞免疫應答的Id2和在自身免疫和炎癥中起關鍵作用的Fos（圖5c）。此外，作者發現PRG逆轉了EAU模型小鼠Th17細胞中炎癥和自身免疫相關基因（Pim1、S100a10、Hsap8、Jund）水平的升高（圖5a、d）。
這些結果表明EAU介導的上調基因和過程與Th17功能相關，PRG處理可以逆轉。Id2和Fos通過編碼轉錄因子在免疫應答中發揮重要作用。因此，文中數據中編碼TF的“拯救靶基因”通過數據庫中TF靶基因與Th17細胞中下調的拯救-DEG的交叉來鑒定（附加文件1：圖S5c）。Id2和Fos下游的基因在EAU組的Th17細胞中上調，其被PRG抑制（圖5e）。值得注意的是，Id2下游的基因被確定參與炎癥反應、IL-17信號傳導途徑和Th 17細胞分化的調節，而Fos下游的基因在特定的Th 17相關途徑中不富集（圖5f，g）。這些結果表明Id2可能在Th17細胞分化和功能中起重要作用，并作為PRG干預的關鍵靶點。與這些發現一致，PRG降低了EAU模型小鼠中Th17細胞的高頻率（圖5h）。Th17細胞中Pim1和Id2的趨勢相同（圖5i，j）。
7.PRG通過Id2/Pim1途徑減弱EAU中Th 17細胞分化和致病性
基于先前的研究結果，假設Id2及其靶基因在Th17細胞的分化和功能中起重要作用。通過比較數據庫中Id2的靶基因與Th17細胞的下調的救援DEG的交叉點，并按重要性鑒定前20個“拯救靶基因”（圖6a）。對Th 17細胞的下調的拯救DEG和與T細胞活化、Th 17細胞分化和IL-17信號通路相關的基因進行了表達相關性分析。作者發現，在涉及Id2的相關模塊中，Rora和Hif 1a與Th 17細胞分化密切相關，Junb和Jund與IL-17通路密切相關（圖6 b）。此外，在Id2的“拯救靶基因”中，Pim1與Id2的相關性最顯著（圖6 b，c）。這些結果表明，Id2通過Pim1對Th 17細胞起重要的促進作用。為了驗證這一假設，進行了體外實驗，從EAU模型小鼠中分離出CDLN細胞，并用IRBP1–20或IRBP1–20加HELI（Id 2的抑制劑）對其進行處理。研究證實了HELI降低了CD 4+和Th 17細胞中Id 2的表達（圖S6 b，c），表明HELI對Id 2表達的抑制作用。接下來評估了Id2抑制對Th 17細胞占比的影響，發現高占比的Th 17細胞通過HELI處理降低（圖6d）。值得注意的是，在加入Id2抑制劑HELI后，Th17來源的Pim1表達也顯著降低（圖6 e）。因此，EAU中異常的Id2/Pim1通路可能參與了Th 17細胞的分化和葡萄膜炎的致病性，抑制Id2可以改善這種情況。接下來，作者探索PRG是否調節Id2/Pim1通路以減弱Th 17細胞功能。與體內實驗的結果一致，PRG處理抑制了IRBP1–20誘導的Th 17細胞分化，并通過添加Id2抑制劑而增強（圖S6 d）。類似地，評估Th 17細胞中Id 2和Pim1的水平。IRBP1–20處理增加了Id 2+和Pim1 + Th 17細胞的比例。PRG處理可逆轉這些由IRBP1–20誘導的效應，在PRG和HELI共培養后（圖6f，g），增強這種抑制作用。此外，GM-CSF是區分致病性Th 17細胞與非致病性Th 17細胞的標志物。在IL-23的刺激下，CD 4 + T細胞表面的IL-23R受體傳遞信號，促進Th 17細胞的分化和Th 17細胞分泌IL-17、GM-CSF等致病性細胞因子。靶向GM-CSF抑制Th 17細胞致病性并減輕EAU嚴重程度。流式細胞術表明IL-23R+和GM-CSF + Th 17細胞的比例通過添加IL-23而增加，并且在PRG處理后降低（圖S6 e，f）。提示PRG可通過抑制病理性Id 2/Pim1軸和IL-23/Th 17/GM-CSF信號通路，抑制Th 17細胞功能和Au進展。自身反應性IRBP1–20特異性T細胞的轉移可誘導EAU發展。為了進一步證實PRG對IRBP1–20特異性T細胞的致病性的抑制作用，作者進行了過繼轉移（AT）實驗。EAU模型小鼠的CDLN細胞用IRBP1–20加入PRG（PRG-AT）或溶媒（溶媒-AT）刺激3天。經IRBP1–20特異性T細胞誘導EAU，而經PRG預處理的細胞不能誘導EAU（圖6 h，i）。相應地，與溶媒-AT小鼠相比，PRG-AT小鼠中Id 2+和Pim1 + Th 17細胞的量減少（圖S6g，h）。綜上，作者發現Id2在EAU發育過程中調節Pim1表達和Th 17細胞功能。PRG治療可通過抑制病理性Id 2/Pim1軸和GM-CSF信號傳導來抑制Th 17細胞分化和致病性，進一步調節Th 17/Treg失衡，導致AU的治療。
小結
文章主要研究思路如下：
- 首先通過構建小鼠EAU模型，以及使用PRG進行治療，證明PRG治療確實可顯著改善EA小鼠視網膜病變和炎性細胞浸潤；
- 隨后通過收集CDLN的細胞進行scRNA-seq，構建了正常小鼠，AU小鼠和PRG治療后的免疫細胞圖譜，發現T細胞和BCs是主要變化的細胞類型，且基因轉錄發生改變；
- 進一步在對各個細胞亞群中進行差異基因分析和富集分析后，作者得出PRG逆轉EAU誘導的與細胞分化、細胞活化和細胞因子信號通路相關的基因表達和自身免疫過程，暗示PRG可挽救EAU誘導的BC活化和體液免疫應答；
- 在CD 4 + T細胞亞群在EAU的發展中發揮關鍵作用的背景知識下，進行CD4 T細胞亞群分析，證實了PRG可增加EAU中Th 17的數量和調節功能分子，協調Th 17/Treg失衡;
- 最后，進一步尋找Th17細胞中高度表達的參與免疫功能的基因，發現Id2可調節Pim1的表達，促進Th 17的致病性；而PRG治療可逆轉Pim1的表達，減輕EAU炎癥，治療AU。
總結:
本篇研究闡明了PRG對EAU治療作用的分子機制，通過利用單細胞測序分析了孕激素治療后免疫細胞群的變化，而生信分析和相關實驗進一步闡述了可能的治療機制。最后，作者證實了PRG通過抑制炎癥通路和恢復Th 17/Treg平衡來減輕EAU炎癥的潛力，確定了Id2/Pim1通路是作為EAU期間Th 17細胞致病性的重要途徑，而PRG治療降低了Id2/Pim1途徑的激活和Th 17細胞的分化。綜上所述，這項研究拓寬了我們對PRG治療AU和其他AD的免疫調節機制的理解。
