單細(xì)胞測序--Seurat（上）--創(chuàng)建對象和數(shù)據(jù)預(yù)處理
參考：https://zhuanlan.zhihu.com/p/134124866
需要這三個(gè)文件：
1）barcodes.tsv：樣本中所有的細(xì)胞的條碼。這文件會(huì)按照 matrix.tsv 的順序來排列
[圖片上傳失敗...(image-b39475-1621137785277)]
2）genes.tsv：參照 (reference name)會(huì)按照Ensembl、NCBI、UCSC網(wǎng)站而有所不同， gene symbol會(huì)與 matrix.tsv 的順序一致。
3）matrix.mtx：包含 count matrix，行名與gene.tsv上的行名對應(yīng)，列名與barcodes.tsv相對應(yīng)。
Seurat 內(nèi)的【Read10X()】函數(shù)可以將上述三文件 raw data整合為一個(gè)稀疏矩陣 (sparse matrix) ，
1、加載數(shù)據(jù) Load the PBMC dataset
pbmc.data <- Read10X(data.dir = "filtered_gene_bc_matrices/hg19/")
dim(pbmc.data)
[1] 32738 2700
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data, project = "pbmc3k", min.cells = 3, min.features = 200)
參數(shù) ：
counts: 未標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)，如原始計(jì)數(shù)或TPMs
project: 設(shè)置Seurat對象的項(xiàng)目名稱；默認(rèn)為"SeuratProject"
assay： 與初始輸入數(shù)據(jù)對應(yīng)的分析名稱。
meta.data: 添加到Seurat對象的其他細(xì)胞水平（cell-level）數(shù)據(jù)。一個(gè)matrix，其中行是cell name，列是附加的元數(shù)據(jù)字段。
min.cells --該feature至少在n個(gè)細(xì)胞內(nèi)被覆蓋； 該基因（feature）至少在3個(gè)細(xì)胞中被檢測到
min.features--規(guī)定了至少檢測到這些feature的細(xì)胞。即檢測到的基因至少有200個(gè)細(xì)胞才被用于分析
看看 pbmc 里面有啥
pbmc
An object of class Seurat
13714 features across 2700 samples within 1 assay
Active assay: RNA (13714 features, 0 variable features)
dim(pbmc) #行，列
[1] 13714 2700
head(pbmc@assays))
$RNA
Assay data with 13714 features for 2700 cells
First 10 features:
AL627309.1, AP006222.2, RP11-206L10.2, RP11-206L10.9,
LINC00115, NOC2L, KLHL17, PLEKHN1, RP11-54O7.17, HES4
head(pbmc@meta.data)) QC指標(biāo)存儲(chǔ)
orig.ident nCount_RNA nFeature_RNA
AAACATACAACCAC-1 pbmc3k 2419 779
AAACATTGAGCTAC-1 pbmc3k 4903 1352
AAACATTGATCAGC-1 pbmc3k 3147 1129
AAACCGTGCTTCCG-1 pbmc3k 2639 960
AAACCGTGTATGCG-1 pbmc3k 980 521
AAACGCACTGGTAC-1 pbmc3k 2163 781
head(pbmc@active.assay))
[1] "RNA"
head(pbmc@active.ident))
AAACATACAACCAC-1 AAACATTGAGCTAC-1 AAACATTGATCAGC-1 AAACCGTGCTTCCG-1
pbmc3k pbmc3k pbmc3k pbmc3k
AAACCGTGTATGCG-1 AAACGCACTGGTAC-1
pbmc3k pbmc3k
Levels: pbmc3k
[1] "pbmc3k"
head(rownames(pbmc))
[1] "AL627309.1" "AP006222.2" "RP11-206L10.2" "RP11-206L10.9"
[5] "LINC00115" "NOC2L"
head(colnames(pbmc))
[1] "AAACATACAACCAC-1" "AAACATTGAGCTAC-1" "AAACATTGATCAGC-1"
[4] "AAACCGTGCTTCCG-1" "AAACCGTGTATGCG-1" "AAACGCACTGGTAC-1"
2、標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)處理流程 Standard pre-processing workflow
1）基于質(zhì)量控制指標(biāo)（QC metrics）和刪除不需要的細(xì)胞作進(jìn)一步分析：
Seurat允許根據(jù)任何用戶定義的標(biāo)準(zhǔn)過濾單元格（cells）。
通常使用的QC指標(biāo)：
-
每個(gè)細(xì)胞內(nèi)被檢測到特有的基因（****unique genes****）的數(shù)目，unique feature會(huì)因?yàn)閿?shù)據(jù)質(zhì)量而調(diào)整。
▲低質(zhì)量的細(xì)胞或空的液滴一般含有較少的基因；
▲細(xì)胞雙重態(tài)或多重態(tài)可能呈現(xiàn)異常高的基因count值
細(xì)胞內(nèi)被監(jiān)測到的分子的總數(shù)目（與unique genes高度相關(guān)）
-
匹配到線粒體基因組的read的百分比
▲低質(zhì)量/將要死去的細(xì)胞經(jīng)常呈現(xiàn)過度的線粒體污染情況；
▲使用function計(jì)算線粒體QC metrics, 此function可以計(jì)算源于feature集的count值的百分比
▲使用所有以【MT-】為起始的基因集合，作為線粒體基因集
數(shù)據(jù)質(zhì)控
質(zhì)控的參數(shù)主要有兩個(gè)：
1.每個(gè)細(xì)胞測到的unique feature數(shù)目（unique feature代表一個(gè)細(xì)胞檢測到的基因的數(shù)目，可以根據(jù)數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行調(diào)整）
2.每個(gè)細(xì)胞檢測到的線粒體基因的比例，理論上線粒體基因組與核基因組相比，只占很小一部分。所以線粒體基因表達(dá)比例過高的細(xì)胞會(huì)被過濾。
（參考：https://zhuanlan.zhihu.com/p/145991506）
pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")
"[[" 操作符可以向?qū)ο笤獢?shù)據(jù)添加列
QC metrics 在 Seurat ：head(pbmc@meta.data)) QC指標(biāo)存儲(chǔ)
▲過濾掉擁有 feature count>2500, or < 200 的細(xì)胞；
▲過濾掉含有> 5% 的線粒體 count值的細(xì)胞
使用 VlnPlot（）進(jìn)行可視化****(基因表達(dá)、指標(biāo)、PC分?jǐn)?shù)等)
nFeature RNA: 每個(gè)細(xì)胞所檢測到的基因數(shù)目，也就是以前版本的nGene；
nCount RNA: 每個(gè)細(xì)胞測到所有基因的表達(dá)量之和，即這些基因數(shù)目一共測到的count數(shù)目，也就是以前版本的UMI數(shù)目；
percent.mt: 每個(gè)細(xì)胞所檢測到的線粒體基因，即測到的線粒體基因的比例。
VlnPlot(pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)
FeatureScatter 一般用于可視化 feature-feature 關(guān)系，使用點(diǎn)圖查看兩個(gè)數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性，也可以用于計(jì)算對象的任何東西，i.e. 對象數(shù)據(jù)中的列，PC分?jǐn)?shù)等。
plot1 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.mt")
plot2 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA")
plot1 + plot2
選擇 200< gene 數(shù)目 <2500（根據(jù)violin圖1） & 線粒體數(shù)目 <5%的細(xì)胞（根據(jù)violin圖2）
pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 2500 & percent.mt < 5)
pbmc
An object of class Seurat
13714 features across 2638 samples within 1 assay #genes:13714, cells：2638
Active assay: RNA (13714 features, 0 variable features)
2）數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化Normalizing the data
在去除了數(shù)據(jù)集中不需要的細(xì)胞后，下一步就是標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。默認(rèn)設(shè)置下，使用全局-規(guī)模（global-scaling）的標(biāo)準(zhǔn)化方法 "LogNormalize"，這方法按總體表達(dá)量，對每一個(gè)細(xì)胞的特征表達(dá)量（feature expression）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，乘以一個(gè)比例因子（****scale factor****）（默認(rèn)為10,000），然后log轉(zhuǎn)換此結(jié)果。
標(biāo)準(zhǔn)化后的值儲(chǔ)存在【pbmc[["RNA"]]@data】。
pbmc <- NormalizeData(pbmc, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)
Performing log-normalization
0% 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100%
[----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|
高可變度基因的鑒定（基因的選擇） Identification of highly variable features (feature selection)
下一步，計(jì)算數(shù)據(jù)集里面基因子集，該子集呈現(xiàn)出高度的細(xì)胞間變異（在有些細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，在其他細(xì)胞內(nèi)低表達(dá)）。還發(fā)現(xiàn)了專注在下游分析內(nèi)的基因可幫助突出單細(xì)胞數(shù)據(jù)內(nèi)的生物信號(hào)。
Seurat3 ，根據(jù)舊有版本升級(jí)了一下，通過使用【FindVariableFeatures 】函數(shù)，直接對單細(xì)胞數(shù)據(jù)中固有內(nèi)的均值方差（mean-variance）的關(guān)系建模。在默認(rèn)設(shè)置下，每個(gè)數(shù)據(jù)集返回2,000個(gè)feature。這些數(shù)據(jù)會(huì)被用于下游數(shù)據(jù)分析，如PCA。
pbmc <- FindVariableFeatures(pbmc, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)
#鑒定前10個(gè)高度可變的基因 Identify the 10 most highly variable genes
top10 <- head(VariableFeatures(pbmc), 10)
top10
[1] "PPBP" "LYZ" "S100A9" "IGLL5" "GNLY" "FTL" "PF4" "FTH1"
[9] "GNG11" "S100A8"
#在有l(wèi)abel或無label下，畫出2000個(gè)高變異的基因
plot1 <- VariableFeaturePlot(pbmc)
plot2 <- LabelPoints(plot = plot1, points = top10, repel = TRUE)
plot1 + plot2
或
CombinePlots(plots = list(plot1, plot2))
對數(shù)據(jù)去中心化 Scaling the data
使用線性轉(zhuǎn)換(縮放'scaling')，它是一個(gè)降維技巧（如PCA）的標(biāo)準(zhǔn)預(yù)處理步驟，
目的:所謂去中心化，就是將樣本X中的每個(gè)觀測值都減掉樣本均值，這樣做的好處是能夠使得求解協(xié)方差矩陣變得更容易。（參考：http://www.lxweimin.com/p/c2850302b644）
【ScaleData】函數(shù)：
▲轉(zhuǎn)換每個(gè)基因的表達(dá)量，使得細(xì)胞之間的平均表達(dá)量為0；
▲按比例縮小每個(gè)基因的表達(dá)量，使得細(xì)胞之間的方差（variance）為1；
?此步驟給予了下游分析的同等權(quán)重（equal weight），使得高表達(dá)基因不會(huì)占主要地位；
▲改結(jié)果會(huì)被儲(chǔ)存在【pbmc[["RNA"]]@scale.data】
all.genes <- rownames(pbmc)
pbmc <- ScaleData****(pbmc, features = all.genes)
? 在【Seurat v2】里面，可以使用【ScaleData】函數(shù)來去除單細(xì)胞數(shù)據(jù)集里面一些不需要的變量來源。例如，我們可以“退回（regress out）”與例如細(xì)胞周期階段相關(guān)的異質(zhì)性，或與線粒體污染相關(guān)的異質(zhì)性。
pbmc <- ScaleData(pbmc, vars.to.regress = "percent.mt")
<meta name="source" content="lake">
單細(xì)胞測序--Seurat（下）--線性降維、識(shí)別差異基因、分配細(xì)胞類型標(biāo)識(shí)
1、先跑 PCA 進(jìn)行線性降維 Perform linear dimensional reduction
Seurat 在識(shí)別細(xì)胞亞型時(shí)，先用 PCA 挑出幾個(gè)貢獻(xiàn)率最大的主成分，再用已選出的主成分分值來將進(jìn)一步聚類分析，而非全部細(xì)胞一次性進(jìn)行聚類分析。
pbmc <- RunPCA(pbmc, features = VariableFeatures(object = pbmc))
多種可視化 PCA 結(jié)果的方法 Examine and visualize PCA results a few different ways
（1）
print(pbmc[["pca"]], dims = 1:5, nfeatures = 5) #將其分為5個(gè)主成分
PC_ 1
Positive: CST3, TYROBP, LST1, AIF1, FTL
Negative: MALAT1, LTB, IL32, IL7R, CD2
PC_ 2
Positive: CD79A, MS4A1, TCL1A, HLA-DQA1, HLA-DQB1
Negative: NKG7, PRF1, CST7, GZMB, GZMA
PC_ 3
Positive: HLA-DQA1, CD79A, CD79B, HLA-DQB1, HLA-DPB1
Negative: PPBP, PF4, SDPR, SPARC, GNG11
PC_ 4
Positive: HLA-DQA1, CD79B, CD79A, MS4A1, HLA-DQB1
Negative: VIM, IL7R, S100A6, IL32, S100A8
PC_ 5
Positive: GZMB, NKG7, S100A8, FGFBP2, GNLY
Negative: LTB, IL7R, CKB, VIM, MS4A7
（2）
VizDimLoadings(pbmc, dims = 1:2, reduction = "pca") #將其分成兩個(gè)主成分
（3）
DimPlot(pbmc, reduction = "pca")
（4）
可使用【DimHeatmap】對數(shù)據(jù)集內(nèi)的異質(zhì)性的主要數(shù)據(jù)作簡單探索，在決定哪個(gè)PC可包含在內(nèi)被用作下有分析時(shí)，此函數(shù)顯得特別有用。細(xì)胞和feature根據(jù)PCA的打分值來設(shè)置。設(shè)置【cells】為一數(shù)值繪制出范圍兩端的“極端”細(xì)胞，這可顯著地加速大數(shù)據(jù)集圖表的繪制。盡管這是一監(jiān)督算法分析，發(fā)現(xiàn)這仍是用于探索相關(guān)feature特征的有價(jià)值的工具。
DimHeatmap(pbmc, dims = 1, cells = 500, balanced = TRUE)
DimHeatmap(pbmc, dims = 1:15, cells = 500, balanced = TRUE)
2、評估最顯著的主成分，決定數(shù)據(jù)集的維數(shù) Determine the 'dimensionality' of the dataset
使用了受JackStraw 程序啟發(fā)的重新取樣測試（ resampling test ）。鑒定了“顯著的”PC作為那些擁有低P-value特征的強(qiáng)有力的富集。
bmc <- JackStraw(pbmc, num.replicate = 100) #此步耗時(shí)較長
pbmc <- ScoreJackStraw(pbmc, dims = 1:20)
【JackStrawPlot】函數(shù)為每一個(gè)PC的P-value的分布與一均勻分布（ uniform distribution）的對比提供了可視化的工具（虛線）。“顯著的”PC會(huì)顯示帶有較低的P-value的特征的強(qiáng)富集（實(shí)線上的虛線）。在此情況下，在第一個(gè)10~12 PC之后，有一個(gè)顯著的斷崖式下降。
JackStrawPlot(pbmc, dims = 1:15)
可見下圖前5個(gè)PC 與后5個(gè)PC顯著分開，挑選 p-value < 0.05的主成分。
3、細(xì)胞的聚類分析 Cluster the cells
【FindNeighbors】函數(shù)將細(xì)胞距離矩陣分區(qū)為小聚群，將一圖劃分為高度互通的“quasi-cliques”或“communities”內(nèi)。該函數(shù)將先前定義好的數(shù)據(jù)集（起初10個(gè)PC）的維度作為輸入。
pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:10)
pbmc <- F****indClusters(pbmc, resolution = 0.5)
Modularity Optimizer version 1.3.0 by Ludo Waltman and Nees Jan van Ec
Number of nodes: 2638
Number of edges: 96033
Running Louvain algorithm...
Maximum modularity in 10 random starts: 0.8720
Number of communities: 9
Elapsed time: 0 seconds
查看前五個(gè)聚類ID結(jié)果:
head(Idents(pbmc), 5)
AAACATACAACCAC-1 AAACATTGAGCTAC-1 AAACATTGATCAGC-1 AAACCGTGCTTCCG-1
1 3 1 2
AAACCGTGTATGCG-1
6
Levels: 0 1 2 3 4 5 6 7 8
4、UMAP/tSNE的非線性降維分析 Run non-linear dimensional reduction (UMAP/tSNE)
非線性多降維的技巧，如 tSNE 和 UMAP，用于可視化和探索這些數(shù)據(jù)集。它們將相似的細(xì)胞放置在低維度的空間，使用相同的 PC 作為聚類分群分析的它們輸入數(shù)據(jù)。可設(shè)置 【label = TRUE】或【LabelClusters】函數(shù)幫助標(biāo)記細(xì)胞群。
pbmc <- RunUMAP(pbmc, dims = 1:10)
DimPlot(pbmc, reduction = "umap")
5、識(shí)別差異表達(dá)的 marker 基因 Finding differentially expressed features (cluster biomarkers)
Seurat可尋找通過差異表達(dá)決定分群的 markers。【FindAllMarkers】函數(shù)自動(dòng)化完成所有小集群的分組，你可以測試小集群的分組，或其他細(xì)胞與細(xì)胞之間的，或針對所有細(xì)胞的分組。【ident.1】函數(shù)鑒定了單一群落里面的陽性和陰性細(xì)胞（positive and negative markers）。
【min.pct】需要檢測到兩組之間最小的差異，這差異必須是存在一定量的差異表達(dá)。
找出 cluster1 中所有的marker
cluster1.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 1, min.pct = 0.25)
head(cluster1.markers, n = 5)
p_val avg_logFC pct.1 pct.2 p_val_adj
IL32 1.894810e-92 0.8373872 0.948 0.464 2.598542e-88
LTB 7.953303e-89 0.8921170 0.981 0.642 1.090716e-84
CD3D 1.655937e-70 0.6436286 0.919 0.431 2.270951e-66
IL7R 3.688893e-68 0.8147082 0.747 0.325 5.058947e-64
LDHB 2.292819e-67 0.6253110 0.950 0.613 3.144372e-63
找出區(qū)別于cluster 0 和cluster 3 與c luster 5的所有標(biāo)記
cluster5.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 5, ident.2 = c(0, 3), min.pct = 0.25)
head(cluster5.markers, n = 5)
p_val avg_logFC pct.1 pct.2 p_val_adj
FCGR3A 7.583625e-209 2.963144 0.975 0.037 1.040018e-204
IFITM3 2.500844e-199 2.698187 0.975 0.046 3.429657e-195
CFD 1.763722e-195 2.362381 0.938 0.037 2.418768e-191
CD68 4.612171e-192 2.087366 0.926 0.036 6.325132e-188
RP11-290F20.3 1.846215e-188 1.886288 0.840 0.016 2.531900e-184
找出與所有剩余細(xì)胞對比的，每個(gè)cluster的標(biāo)記，僅匯報(bào)陽性細(xì)胞
pbmc.markers <- FindAllMarkers(pbmc, only.pos = TRUE, min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25)
pbmc.markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 2, wt = avg_logFC) #管道符號(hào)
Registered S3 method overwritten by 'cli':
method from
print.boxx spatstat
A tibble: 18 x 7
Groups: cluster [9]
p_val avg_logFC pct.1 pct.2 p_val_adj cluster gene
1 1.96e-107 0.730 0.901 0.594 2.69e-103 0 LDHB
2 1.61e- 82 0.922 0.436 0.11 2.20e- 78 0 CCR7
3 7.95e- 89 0.892 0.981 0.642 1.09e- 84 1 LTB
4 1.85e- 60 0.859 0.422 0.11 2.54e- 56 1 AQP3
5 0. 3.86 0.996 0.215 0. 2 S100A9
6 0. 3.80 0.975 0.121 0. 2 S100A8
7 0. 2.99 0.936 0.041 0. 3 CD79A
8 9.48e-271 2.49 0.622 0.022 1.30e-266 3 TCL1A
9 2.96e-189 2.12 0.985 0.24 4.06e-185 4 CCL5
10 2.57e-158 2.05 0.587 0.059 3.52e-154 4 GZMK
11 3.51e-184 2.30 0.975 0.134 4.82e-180 5 FCGR3A
12 2.03e-125 2.14 1 0.315 2.78e-121 5 LST1
13 7.95e-269 3.35 0.961 0.068 1.09e-264 6 GZMB
14 3.13e-191 3.69 0.961 0.131 4.30e-187 6 GNLY
15 1.48e-220 2.68 0.812 0.011 2.03e-216 7 FCER1A
16 1.67e- 21 1.99 1 0.513 2.28e- 17 7 HLA-DPB1
17 7.73e-200 5.02 1 0.01 1.06e-195 8 PF4
18 3.68e-110 5.94 1 0.024 5.05e-106 8 PPBP
Seurat有多種微分表達(dá)式測試（tests for differential expression），可以在【test.use】參數(shù)內(nèi)被設(shè)置。例如，ROC 測試會(huì)給任何獨(dú)立的maker（范圍由0-隨機(jī)，到1-完美）返回一個(gè)“分類能力”。
cluster1.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 0, logfc.threshold = 0.25, test.use = "roc", only.pos = TRUE)
【VlnPlot】顯示了集群里面表達(dá)量的概率分布，【FeaturePlot】（可用于可視化 tSNE 或 PCA圖的特征表達(dá)量）是最經(jīng)常使用的可視化工具。建議探索【 RidgePlot】、【CellScatter】和【DotPlot】 作為另一種方法來探索數(shù)據(jù)集。
VlnPlot(pbmc, features = c("MS4A1", "CD79A"))
使用 raw counts 畫圖
VlnPlot(pbmc, features = c("NKG7", "PF4"), slot = "counts****", log = TRUE)
FeaturePlot(pbmc, features = c("MS4A1", "GNLY", "CD3E", "CD14", "FCER1A", "FCGR3A", "LYZ", "PPBP",
"CD8A"))
【DoHeatmap】對給定的細(xì)胞和特征生成一熱圖。在本例子中，我們對每個(gè)集群畫出前20個(gè)marker（如果marker量少于20就全部的畫上）
top10 <- pbmc.markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 10, wt = avg_logFC)
DoHeatmap(pbmc, features = top10$gene) + NoLegend()
6、給cluster 分配細(xì)胞類型標(biāo)識(shí) Assigning cell type identity to clusters
使用規(guī)范 marker ，以便匹配無偏倚的聚類到已知的細(xì)胞類型。
names(new.cluster.ids) <- levels(pbmc)
pbmc <- RenameIdents(pbmc, new.cluster.ids)
DimPlot(pbmc, reduction = "umap", label = TRUE, pt.size = 0.5) + NoLegend()
saveRDS(pbmc, file = "../pbmc3k_final.rds")
參考:單細(xì)胞測序--Seurat（下）--線性降維、識(shí)別差異基因、分配細(xì)胞類型標(biāo)識(shí) · 語雀 (yuque.com)
