第一代
桑格爾-雙脫氧鏈終止法
原理
固定的點(diǎn)開始
隨機(jī)在某一個特定的堿基處終止
并且在每個堿基后面進(jìn)行熒光標(biāo)記
產(chǎn)生以A、T、C、G結(jié)束的四組不同長度的一系列核苷酸
尿素變性的PAGE膠上電泳檢測獲得可見DNA堿基序列
優(yōu)點(diǎn)
準(zhǔn)確性高達(dá)99.999%
缺點(diǎn)
通量低
1000bp
第二代
循環(huán)陣列合成測序法/高通量測序技術(shù)
原理
先將片段化的DNA兩側(cè)連上接頭
用固著著芯片的引物進(jìn)行Bridge PCR
得到上百萬條相同的DNA簇
再加入4種不同熒光標(biāo)記的終止型dNTP，每滲入一個此dNTP反應(yīng)即終止
洗去未參加的dNTP后讀取熒光數(shù)據(jù)，得到一個位點(diǎn)的序列
切去終止dNTP上的阻斷基團(tuán)后即可進(jìn)入下一輪測序
如此循環(huán)50次左右
同時對上百萬個DNA簇進(jìn)行邊和成邊測序
最后用計算機(jī)進(jìn)行分析
得到DNA簇的序列
最后拼成全基因組序列。
優(yōu)點(diǎn)
增加數(shù)據(jù)產(chǎn)出
降低測序成本
代表
Illumina公司推出的HiSeq2000、1500/2500、3000/4000、HiSeq X-ten MiSeq、NextSeq500
Life公司推出的Ion-PGM (Personal Genome Machine)
Ion-Proton Qiagen公司推出的GeneReader NGS system
華大(BGI)收購Complete Genetics后推出的BGISeq-100，BGISeq-1000
Roche公司454 GS FLX plus及454 Junior
Life公司SOLiD 5500
Helicos公司Heliscope
第三代
代表
SMRT
納米孔單分子測序技術(shù)
原理
以單分子為目標(biāo)的邊和成邊測序
優(yōu)點(diǎn)
不需要經(jīng)過PCR擴(kuò)增
實(shí)現(xiàn)對每一條DNA的單獨(dú)測序
關(guān)鍵技術(shù)
熒光標(biāo)記核苷酸
納米微孔
激光共聚焦顯微鏡實(shí)時記錄微孔熒光
遠(yuǎn)長于二代測序技術(shù)的序列讀長
直接測RNA序列
測甲基化的DNA序列
缺點(diǎn)
單讀長錯誤率偏高，需要重復(fù)測序糾錯，以PacBio SMRT技術(shù)為例，錯誤率高達(dá)15%
隨機(jī)出錯，需要進(jìn)行多次測序糾錯，增加了測序成本
對DNA聚合酶活性依賴度也較高
運(yùn)用率沒有二代測序普遍，其生信分析軟件豐富度不夠，積累較少。
