測(cè)序知識(shí)學(xué)習(xí)
一二三代測(cè)序
測(cè)序技術(shù)的發(fā)展史
第一代測(cè)序
在1977年，Sanger等提出了經(jīng)典的雙脫氧核苷酸末端終止測(cè)序法。該方法的原理是：由于ddNTP的2′和3′都不含羥基，在DNA合成反應(yīng)中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以被用來中斷DNA合成反應(yīng)。在4個(gè)DNA合成反應(yīng)體系中分別加入一定比例的帶有放射性同位素標(biāo)記的某種ddNTP，通過凝膠電泳和放射自顯影后，可以根據(jù)電泳帶的位置確定待測(cè)分子的DNA序列。同一年，Gilbert等提出了化學(xué)降解法。該方法與Sanger法類似，都是先得到隨機(jī)長度的DNA鏈，再通過電泳方法讀出序列。二者的不同之處在于，Gilbert法是先用特定的化學(xué)試劑標(biāo)記堿基再用化學(xué)方法打斷待測(cè)序列，而Sanger法是通過ddNTP隨機(jī)中斷合成待測(cè)序列。
此后，在Sanger法的基礎(chǔ)上，80年代中期出現(xiàn)了以熒光標(biāo)記代替放射性同位素標(biāo)記、以熒光信號(hào)接收器和計(jì)算機(jī)信號(hào)分析系統(tǒng)代替放射性自顯影的自動(dòng)測(cè)序儀。另外，90年代中期出現(xiàn)的毛細(xì)管電泳技術(shù)使得測(cè)序的通量大為提高。
除此之外，這一時(shí)期還出現(xiàn)了一些其他的測(cè)序方法，如焦磷酸測(cè)序法（pyro sequencing）、連接酶測(cè)序法（sequencing by ligation, SBL）、雜交測(cè)序法（sequencing by hybridization,SBH）等。其中焦磷酸測(cè)序法即為后來Roche公司454技術(shù)使用的測(cè)序方法，連接酶測(cè)序法即為后來ABI公司SOLiD技術(shù)使用的測(cè)序方法。
一代測(cè)序原理
第二代測(cè)序
2007 年Roche公司推出了Genome SeqencerFLX（GS-FLX）測(cè)序平臺(tái)，建立在454焦磷酸測(cè)序原理上的一種高通量測(cè)序。比起其它二代測(cè)序平臺(tái)，具有較長的讀長。目前GS FLX測(cè)序系統(tǒng)樣品序列片段讀長已超過400bp，而最新的454 GS-FLX+System最長讀長能達(dá)到1kb,平均讀長700bp，而且不需要熒光標(biāo)記的引物或核酸探針，也不需要進(jìn)行電泳，具有分析結(jié)果準(zhǔn)確、快速、靈敏度較高等優(yōu)點(diǎn)。然而，454平臺(tái)的測(cè)序成本比其他新一代測(cè)序平臺(tái)高，并且與其他第二代測(cè)序平臺(tái)相比，無法準(zhǔn)確測(cè)量同聚物的長度會(huì)導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確，但該技術(shù)在基因組從頭測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組分析等領(lǐng)域仍有著廣泛的應(yīng)用。
2006 年，Illumina公司收購Solexa公司，獲得新一代高通量測(cè)序技術(shù)并把該技術(shù)發(fā)展成為市場(chǎng)上的主流技術(shù)，目前提供HiSeq4000、HiSeq3000、HiSeq2000、HiSeq2500/1500、Genome AnalyzerIIx、MiSeq等測(cè)序系統(tǒng)。Hiseq是一種基于單分子簇的邊合成邊測(cè)序技術(shù)，基于專有的可逆終止化學(xué)反應(yīng)原理，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化樣本制備和大規(guī)模平行測(cè)序，其文庫片段的擴(kuò)增是通過橋式PCR來實(shí)現(xiàn)。Hiseq2500測(cè)序儀雖然具有高準(zhǔn)確性，高通量，高靈敏度，和低運(yùn)行成本等突出優(yōu)勢(shì)，但是，基于DNA模板擴(kuò)增，其在組裝高GC含量基因組時(shí)尤其受限，最重要是較短的測(cè)序讀長不利于組裝基因組。目前HiSeq3000/4000測(cè)序儀是基于HiSeq2500系統(tǒng)流動(dòng)槽技術(shù)發(fā)明的對(duì)人類基因組學(xué)測(cè)序有很大益處的世界最先進(jìn)的高通量測(cè)序平臺(tái)。雙流動(dòng)槽的HiSeq4000系統(tǒng)具有更長的讀長，更高的通量和更短的測(cè)序時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)而應(yīng)用廣泛。而單流動(dòng)槽的HiSeq3000系統(tǒng)則享有同樣的低價(jià)格和快速運(yùn)行時(shí)間。基因組重測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和外顯子等方面的應(yīng)用依然廣泛。
MiSeq測(cè)序儀是小型測(cè)序平臺(tái)，以邊合成邊測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)，通過可逆終止方法對(duì)數(shù)百萬個(gè)片段同時(shí)進(jìn)行大規(guī)模平行測(cè)序，具有測(cè)序速度快，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確率高的優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)300bp×2的測(cè)序長度，主要在微生物多樣性分析、宏基因組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組de novo測(cè)序、微生物基因組測(cè)序、小RNA測(cè)序、表達(dá)譜、ChIP-Seq中的應(yīng)用較多。目前，Illumina公司2014年推出的新一代Hiseq X Ten測(cè)序儀已實(shí)現(xiàn)1000 美元完成一個(gè)人類基因組的目標(biāo)。
ABI公司則主要是SOLiD 3和SOLiD 4兩個(gè)測(cè)序平臺(tái)，與Solexa的合成測(cè)序?qū)Ρ龋琒OLiD 測(cè)序技術(shù)擁有第二代測(cè)序反應(yīng)中最高的通量，是邊合成邊測(cè)序過程中采用連接反應(yīng)而不是聚合反應(yīng)。其基本原理是以四色熒光標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行多次連接合成。
SOLiD 測(cè)序技術(shù)的獨(dú)特點(diǎn)在于“雙堿基編碼”的應(yīng)用，使每個(gè)堿基被閱讀兩次，校對(duì)原始數(shù)據(jù)而避免錯(cuò)誤，以此保證SOLiD系統(tǒng)原始?jí)A基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率大于99.94%。但其存在的不足是在熒光解碼階段，鑒于其是雙堿基確定一個(gè)熒光信號(hào)，因而一旦發(fā)生錯(cuò)誤就容易產(chǎn)生連鎖的解碼錯(cuò)誤。目前該技術(shù)多應(yīng)用在基因組重測(cè)序、基因型分析、基因表達(dá)分析、小分子RNA、表觀組學(xué)測(cè)序（染色質(zhì)免疫共沉淀和DNA甲基化）等領(lǐng)域。
第二代測(cè)序技術(shù)的突出點(diǎn)是以高通量、低成本為主，然而，第二代測(cè)序的較短讀長不利于生物信息學(xué)分析，而且，擴(kuò)增PCR前后的DNA分子片段數(shù)目比例有偏差，這對(duì)基因表達(dá)、尤其是對(duì)大量表達(dá)的基因影響會(huì)更大。這些缺點(diǎn)在一定程度上制約了第二代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展，推進(jìn)第三代單分子測(cè)序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。
第三代測(cè)序
測(cè)序技術(shù)在近兩三年中又有新的里程碑。以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies納米孔單分子測(cè)序技術(shù)，被稱之為第三代測(cè)序技術(shù)。與前兩代相比，他們最大的特點(diǎn)就是單分子測(cè)序，測(cè)序過程無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
其中PacBio SMRT技術(shù)其實(shí)也應(yīng)用了邊合成邊測(cè)序的思想5，并以SMRT芯片為測(cè)序載體。基本原理是： DNA聚合酶和模板結(jié)合,4色熒光標(biāo)記 4 種堿基（即是dNTP）,在堿基配對(duì)階段,不同堿基的加入,會(huì)發(fā)出不同光,根據(jù)光的波長與峰值可判斷進(jìn)入的堿基類型。同時(shí)這個(gè) DNA 聚合酶是實(shí)現(xiàn)超長讀長的關(guān)鍵之一,讀長主要跟酶的活性保持有關(guān),它主要受激光對(duì)其造成的損傷所影響。PacBio SMRT技術(shù)的一個(gè)關(guān)鍵是怎樣將反應(yīng)信號(hào)與周圍游離堿基的強(qiáng)大熒光背景區(qū)別出來。他們利用的是ZMW（零模波導(dǎo)孔）原理：如同微波爐壁上可看到的很多密集小孔。小孔直徑有考究,如果直徑大于微波波長,能量就會(huì)在衍射效應(yīng)的作用下穿透面板而泄露出來，從而與周圍小孔相互干擾。如果孔徑小于波長,能量不會(huì)輻射到周圍，而是保持直線狀態(tài)（光衍射的原理）,從而可起保護(hù)作用。同理,在一個(gè)反應(yīng)管(SMRTCell:單分子實(shí)時(shí)反應(yīng)孔)中有許多這樣的圓形納米小孔, 即 ZMW(零模波導(dǎo)孔),外徑 100多納米,比檢測(cè)激光波長小(數(shù)百納米),激光從底部打上去后不能穿透小孔進(jìn)入上方溶液區(qū),能量被限制在一個(gè)小范圍(體積20X 10-21 L)里,正好足夠覆蓋需要檢測(cè)的部分,使得信號(hào)僅來自這個(gè)小反應(yīng)區(qū)域,孔外過多游離核苷酸單體依然留在黑暗中,從而實(shí)現(xiàn)將背景降到最低。另外，可以通過檢測(cè)相鄰兩個(gè)堿基之間的測(cè)序時(shí)間，來檢測(cè)一些堿基修飾情況，既如果堿基存在修飾，則通過聚合酶時(shí)的速度會(huì)減慢，相鄰兩峰之間的距離增大，可以通過這個(gè)來之間檢測(cè)甲基化等信息。SMRT技術(shù)的測(cè)序速度很快，每秒約10個(gè)dNTP。但是，同時(shí)其測(cè)序錯(cuò)誤率比較高（這幾乎是目前單分子測(cè)序技術(shù)的通病），達(dá)到15%,但好在它的出錯(cuò)是隨機(jī)的，并不會(huì)像第二代測(cè)序技術(shù)那樣存在測(cè)序錯(cuò)誤的偏向，因而可以通過多次測(cè)序來進(jìn)行有效的糾錯(cuò)。
Oxford Nanopore Technologies公司所開發(fā)的納米單分子測(cè)序技術(shù)與以往的測(cè)序技術(shù)皆不同，它是基于電信號(hào)而不是光信號(hào)的測(cè)序技術(shù)5。該技術(shù)的關(guān)鍵之一是，他們?cè)O(shè)計(jì)了一種特殊的納米孔，孔內(nèi)共價(jià)結(jié)合有分子接頭。當(dāng)DNA堿基通過納米孔時(shí)，它們使電荷發(fā)生變化，從而短暫地影響流過納米孔的電流強(qiáng)度（每種堿基所影響的電流變化幅度是不同的），靈敏的電子設(shè)備檢測(cè)到這些變化從而鑒定所通過的堿基。
該公司在去年基因組生物學(xué)技術(shù)進(jìn)展年會(huì)(AGBT)上推出第一款商業(yè)化的納米孔測(cè)序儀，引起了科學(xué)界的極大關(guān)注。納米孔測(cè)序（和其他第三代測(cè)序技術(shù)）有望解決目前測(cè)序平臺(tái)的不足，納米孔測(cè)序的主要特點(diǎn)是：讀長很長，大約在幾十kb，甚至100 kb;錯(cuò)誤率目前介于1%至4%，且是隨機(jī)錯(cuò)誤，而不是聚集在讀取的兩端;數(shù)據(jù)可實(shí)時(shí)讀取;通量很高(30x人類基因組有望在一天內(nèi)完成);起始DNA在測(cè)序過程中不被破壞;以及樣品制備簡單又便宜。理論上，它也能直接測(cè)序RNA。
納米孔單分子測(cè)序計(jì)算還有另一大特點(diǎn)，它能夠直接讀取出甲基化的胞嘧啶，而不必像傳統(tǒng)方法那樣對(duì)基因組進(jìn)行bisulfite處理。這對(duì)于在基因組水平直接研究表觀遺傳相關(guān)現(xiàn)象有極大的幫助。并且改方法的測(cè)序準(zhǔn)確性可達(dá)99.8%，而且一旦發(fā)現(xiàn)測(cè)序錯(cuò)誤也能較容易地進(jìn)行糾正。但目前似乎還沒有應(yīng)用該技術(shù)的相關(guān)報(bào)道。
目前還有一種基于半導(dǎo)體芯片的新一代革命性測(cè)序技術(shù)——Ion Torrent6。該技術(shù)使用了一種布滿小孔的高密度半導(dǎo)體芯片， 一個(gè)小孔就是一個(gè)測(cè)序反應(yīng)池。當(dāng)DNA聚合酶把核苷酸聚合到延伸中的DNA鏈上時(shí)，會(huì)釋放出一個(gè)氫離子，反應(yīng)池中的PH發(fā)生改變，位于池下的離子感受器感受到H+離子信號(hào)，H+離子信號(hào)再直接轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，從而讀出DNA序列。這一技術(shù)的發(fā)明人同時(shí)也是454測(cè)序技術(shù)的發(fā)明人之一——Jonathan Rothberg，它的文庫和樣本制備跟454技術(shù)很像，甚至可以說就是454的翻版，只是測(cè)序過程中不是通過檢測(cè)焦磷酸熒光顯色，而是通過檢測(cè)H+信號(hào)的變化來獲得序列堿基信息。Ion Torrent相比于其他測(cè)序技術(shù)來說，不需要昂貴的物理成像等設(shè)備，因此，成本相對(duì)來說會(huì)低，體積也會(huì)比較小，同時(shí)操作也要更為簡單，速度也相當(dāng)快速，除了2天文庫制作時(shí)間，整個(gè)上機(jī)測(cè)序可在2-3.5小時(shí)內(nèi)完成，不過整個(gè)芯片的通量并不高，目前是10G左右，但非常適合小基因組和外顯子驗(yàn)證的測(cè)序。
在網(wǎng)上看到一段話形象描述三代測(cè)序的不同，原話是這樣的
用一個(gè)簡單的比喻來解釋這幾代技術(shù)。
任務(wù)：做1000張?jiān)嚲怼?br> 一代測(cè)序：一個(gè)人一次只能做50張?jiān)嚲恚运麩o法做完這1000張。
二代測(cè)序：有500個(gè)人，每個(gè)人一次只能做10張?jiān)嚲恚颐總€(gè)人隨機(jī)做這1000張中的10張?jiān)嚲恚詈髤R總這500個(gè)人做的試卷，去除重復(fù)做的把不同的統(tǒng)一起來，這樣可以最大限度得完成1000張?jiān)嚲怼?br> 三代測(cè)序：有30人，每個(gè)人一次能做100張?jiān)嚲恚蟮暮投粯樱瑓R總結(jié)果。
這樣是不是相對(duì)形象了一點(diǎn)（純屬幫助理解）。
最后來張網(wǎng)上的圖總結(jié)
二代測(cè)序大體流程
由于Illumina公司的Solexa和Hiseq應(yīng)該說是目前全球使用量最大的第二代測(cè)序機(jī)器，所以只記錄Solexa的原理。
（1）DNA待測(cè)文庫構(gòu)建
利用超聲波把待測(cè)的DNA樣本打斷成小片段，目前除了組裝之外和一些其他的特殊要求之外，主要是打斷成200-500bp長的序列片段，并在這些小片段的兩端添加上不同的接頭，構(gòu)建出單鏈DNA文庫。
（2）Flowcell
Flowcell是用于吸附流動(dòng)DNA片段的槽道，當(dāng)文庫建好后，這些文庫中的DNA在通過flowcell的時(shí)候會(huì)隨機(jī)附著在flowcell表面的channel上。每個(gè)Flowcell有8個(gè)channel，每個(gè)channel的表面都附有很多接頭，這些接頭能和建庫過程中加在DNA片段兩端的接頭相互配對(duì)（這就是為什么flowcell能吸附建庫后的DNA的原因），并能支持DNA在其表面進(jìn)行橋式PCR的擴(kuò)增。
（3）橋式PCR擴(kuò)增與變性
橋式PCR以Flowcell表面所固定的接頭為模板，進(jìn)行橋形擴(kuò)增，如圖4.a所示。經(jīng)過不斷的擴(kuò)增和變性循環(huán)，最終每個(gè)DNA片段都將在各自的位置上集中成束，每一個(gè)束都含有單個(gè)DNA模板的很多分拷貝，進(jìn)行這一過程的目的在于實(shí)現(xiàn)將堿基的信號(hào)強(qiáng)度放大，以達(dá)到測(cè)序所需的信號(hào)要求。
（4）測(cè)序
測(cè)序方法采用邊合成邊測(cè)序的方法。向反應(yīng)體系中同時(shí)添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標(biāo)記的4中dNTP（如同Sanger測(cè)序法）。這些dNTP的3’-OH被化學(xué)方法所保護(hù)，因而每次只能添加一個(gè)dNTP。在dNTP被添加到合成鏈上后，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會(huì)被洗脫掉。接著，再加入激發(fā)熒光所需的緩沖液，用激光激發(fā)熒光信號(hào)，并有光學(xué)設(shè)備完成熒光信號(hào)的記錄，最后利用計(jì)算機(jī)分析將光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為測(cè)序堿基。這樣熒光信號(hào)記錄完成后，再加入化學(xué)試劑淬滅熒光信號(hào)并去除dNTP 3’-OH保護(hù)基團(tuán)，以便能進(jìn)行下一輪的測(cè)序反應(yīng)。Illumina的這種測(cè)序技術(shù)每次只添加一個(gè)dNTP的特點(diǎn)能夠很好的地解決同聚物長度的準(zhǔn)確測(cè)量問題，它的主要測(cè)序錯(cuò)誤來源是堿基的替換，目前它的測(cè)序錯(cuò)誤率在1%-1.5%之間，測(cè)序周期以人類基因組重測(cè)序?yàn)槔?0x測(cè)序深度大約為1周。
組學(xué)知識(shí)
1.基因組學(xué)（核酸序列分析）
（1）全基因組測(cè)序（WGS）
（2）全外顯子組測(cè)序（WES）
（3）簡化基因組測(cè)序（RRGS）
①RAD-Seq
②GBS
③2bRAD
④ddGBS（也就是ddRAD）
作用：
（1）基因組作圖（遺傳圖譜、物理圖譜、轉(zhuǎn)錄本圖譜）
（2）核苷酸序列分析
（3）基因定位
（4）基因功能分析
其它：
以全基因組測(cè)序?yàn)槟繕?biāo)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)
以基因功能鑒定為目標(biāo)的功能基因組學(xué)
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2.轉(zhuǎn)錄組學(xué)（基因表達(dá)分析）
（1）mRNA-Seq
（2）IncRNA-Seq（長鏈非編碼RNA）
（3）sRNA-Seq（主要是miRNA-Seq）
作用：
（1）獲得物種或者組織的轉(zhuǎn)錄本信息
（2）得到轉(zhuǎn)錄本上基因的相關(guān)信息，如基因結(jié)構(gòu)功能等
（3）發(fā)現(xiàn)新的基因
（4）基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化
（5）發(fā)現(xiàn)可變剪切
（6）發(fā)現(xiàn)基因融合
（7）基因表達(dá)差異分析
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3.蛋白質(zhì)組學(xué)
（1）蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)處理、蛋白及其修飾鑒定
（2）構(gòu)建蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫、相關(guān)軟件的開發(fā)和應(yīng)用
（3）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)
（4）蛋白質(zhì)連鎖圖
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4.代謝組學(xué)
（1）代謝物指紋分析
（2）代謝輪廓分析
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通過一晚上的學(xué)習(xí)，包括幾篇文章以及Illumina公司官方視頻和“陳巍學(xué)基因”視頻，大概清楚了測(cè)序的原理及實(shí)驗(yàn)過程。
這幾天在豆豆和花花的帶領(lǐng)下，收獲頗多，感覺自身的知識(shí)提升了不少，在這里感謝二位幸苦的付出。以后要學(xué)的東西還很多，希望這個(gè)頭開得有效果，也希望自己能克服懶惰的毛病，堅(jiān)持學(xué)下去。
