文章信息今天分享的這篇文章于2019年10月9日發(fā)表在期刊Nature上，文章題目為：Decoding human fetal liverhaematopoiesis 。DOI號(hào)為：https://doi.org/10.1038/s41586-019-1652-y.
** 摘 要 **
通過(guò)10x Genomics 和 Smart-seq2單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)對(duì)不同胎齡的14個(gè)胎肝樣本、7個(gè)皮膚樣本、3個(gè)腎臟樣本、3個(gè)卵黃囊樣本進(jìn)行測(cè)序，獲得了138,575個(gè)胎兒肝臟細(xì)胞及約74,000個(gè)皮膚，腎臟和卵黃囊細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組譜。推斷了造血干細(xì)胞/多能祖細(xì)胞（HSC/MPP）的發(fā)育軌跡，定義胎肝造血過(guò)程中紅系、淋系及髓系各個(gè)階段的造血細(xì)胞，首次發(fā)現(xiàn)了胎兒皮膚中存在成紅前體細(xì)胞，卵黃囊中存在肥大細(xì)胞，NK細(xì)胞及固有淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞。隨著妊娠的進(jìn)展，胎肝HSC/MPP分化成為紅細(xì)胞的比例降低，髓系及淋系的比例增高，與此同時(shí)HSC/MPP的分化潛能也發(fā)生了變化。
方法及分析概覽
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樣品：共收集17個(gè)胎兒標(biāo)本，包括14個(gè)肝臟樣本、7個(gè)皮膚樣本、3個(gè)腎臟樣本、3個(gè)卵黃囊標(biāo)本，其中皮膚、腎臟被稱為非淋巴組織（non-lymphoid tissues，NLTs）。樣品詳細(xì)信息如下：
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建庫(kù)測(cè)序：10x Genomics樣本通過(guò)3’ v2 試劑及 V(D)J Reagent Kits建庫(kù)后通過(guò)Illumina HiSeq 4000 測(cè)序；Smart-seq2樣本通過(guò)Illumina Nextera XT kit (Illumina)測(cè)序。
數(shù)據(jù)上游分析：10x Genomics 測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)Cell Ranger軟件進(jìn)行的比對(duì)及定量，參考基因組為GRCh38 人類參考基因組。Smart-seq2 測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)STAR軟件進(jìn)行比對(duì)。使用htseq-count（v.0.10.0）計(jì)算基因的read計(jì)數(shù)。
質(zhì)量控制：除去表達(dá)< 200個(gè)基因且線粒體基因>20％的細(xì)胞，除去少于3個(gè)細(xì)胞中表達(dá)的基因。用Scrublet去除Doublets。最終獲得了138,575（n = 14）個(gè)胎兒肝臟細(xì)胞（使用Smart-seq2分析了1,206個(gè)細(xì)胞），54,690（n = 7）個(gè)皮膚，9,643個(gè)腎臟（n = 3）和10,071個(gè)卵黃囊（n = 3）細(xì)胞。10x Genomics平均每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到約3,000個(gè)基因，使用Smart-seq2平均檢測(cè)到約6,000個(gè)基因/細(xì)胞。
降維、聚類及細(xì)胞定義：應(yīng)用Seurat包（v2.3.4）進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，scaledata, variable gene detection，PCA、TSNE、UMAP降維，Louvain graph-based 聚類。細(xì)胞定義通過(guò)經(jīng)典marker及DEG。胎肝細(xì)胞聚類又加用了兩種聚類方法：agglomerative clustering及Gaussian Mixture，然后用Rand指數(shù)衡量三種聚類方法之間的一致性。細(xì)胞定義完后，通過(guò)胎肝數(shù)據(jù)訓(xùn)練support vector machine (SVM)來(lái)構(gòu)建細(xì)胞類型分類器，之后用SVM細(xì)胞分類器來(lái)定義smart-seq2數(shù)據(jù)的細(xì)胞類型。
樣本整合：相同組織樣本之間整合用Harmony，不同組織樣本之間的整合用Merge (Seurat函數(shù))。kBET衡量批次效應(yīng)。
下游分析：通過(guò)比較FDG，PAGA和diffusion-map推測(cè)發(fā)育軌跡。使用Monocle2中的DifferentialGeneTest函數(shù)計(jì)算偽時(shí)變化的基因。CellPhoneDB推斷細(xì)胞之間相互作用。
功能驗(yàn)證：免疫組化、免疫熒光、HSC/MPP 培養(yǎng)。
主要結(jié)果
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1.構(gòu)建了胎兒肝細(xì)胞圖譜
Fig. 1a 實(shí)驗(yàn)流程
Fig. 1b 胎兒肝臟細(xì)胞圖譜
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Fig. 1c 各妊娠階段中每個(gè)譜系細(xì)胞的比例，胎肝主要以紅系造血為主，但隨著胎齡的增加，紅系比例下降，髓系及淋系比例增加。
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2. 細(xì)胞類型鑒定
Fig. 2a 展示胎肝各種細(xì)胞類型的marker，*表示后續(xù)用于流式分選細(xì)胞鑒定的marker。
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Fig. 2b 通過(guò)選定的marker進(jìn)行流式分選后，Giemsa染色鑒定細(xì)胞類型。
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3. 胎肝及非淋巴組織的造血
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Fig. 3a FDG圖展示所有的造血細(xì)胞，可看到從HSC/MPP向三系的分化軌跡。image.png
- Extended Data Fig. 3a 巨核細(xì)胞、肥大細(xì)胞、成紅細(xì)胞有共同的前體細(xì)胞MEMP (megakaryocyte–erythroid–mast cell progenitor)。分化過(guò)程中動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的基因不同，紅系譜系中的TAL1和KLF1，巨核細(xì)胞譜系中的F11R，PBX1和MEIS1，肥大細(xì)胞分化中的HES1。
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Fig. 3b 從卵黃囊到肝臟，紅細(xì)胞血紅蛋白基因表達(dá)以及從原始血紅蛋白HBZ和HBE1表達(dá)到胎兒血紅蛋白（HBA1和HBG2）表達(dá)的時(shí)間變化。image.png
- Extended Data Fig. 3e 肥大細(xì)胞，巨核細(xì)胞和紅系譜系細(xì)胞在肝、卵黃囊、皮膚、腎臟中均顯示出較高的關(guān)聯(lián)性。
- Extended Data Fig. 3d 皮膚MEMPs表達(dá)了一些早期的成紅細(xì)胞基因，包括MYL4，表明這些細(xì)胞可能充當(dāng)皮膚中的紅細(xì)胞祖細(xì)胞，具有造血功能。
4. 胎肝和非淋巴組織的淋系細(xì)胞生成
- Fig. 4a & 4b 胎肝及非淋巴組織淋系細(xì)胞展示。在胎肝中發(fā)現(xiàn)了淋系兩個(gè)方向分支，NK-T-ILC及B系。與肝臟和卵黃囊相比，非淋巴組織中存在Pro-B，pre-B和B細(xì)胞，但缺少HSC / MPP和pre-B前體細(xì)胞。
- Extended Data Fig. 5h & 5i NLT中的早期淋巴/ T淋巴細(xì)胞，NK細(xì)胞和ILC與肝臟相比相同的基因表達(dá)趨勢(shì)。然而，趨化因子（XCLI和CXCL8）和細(xì)胞毒性顆粒（GNLY）基因的組織特異性表達(dá)表明，在皮膚和腎臟中發(fā)生了NK細(xì)胞的成熟和組織適應(yīng)性。NLT中的ILC前體細(xì)胞缺乏其成熟后代ILC1，ILC2和ILC3的全套特征標(biāo)記和轉(zhuǎn)錄因子。
- Extended Data Fig. 5a 根據(jù)PAGA， NK細(xì)胞（表達(dá)NCAM1，CD7，IL2RB和CD3E）和ILC前體（表達(dá)KIT，KLRB1，IL7R和RORC）在淋巴分支中具有共同的起源。
- Extended Data Fig. 5e HSC / MPP到B細(xì)胞分化過(guò)程中動(dòng)態(tài)變化的基因包括SPIB，SP100和CTSS。
5. 髓樣細(xì)胞組織分布特征
- Fig. 5a & Fig. 5b 胎兒肝臟，胎盤(pán)和卵黃囊的HSC / MPP，髓系祖細(xì)胞，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的FDG圖。
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Extended Data Fig. 6a & 6b. DC分化涉及CLEC11A，BATF3和ID2的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，而單核細(xì)胞分化涉及S100A8 / A9，F(xiàn)CGR1A / 2A和S100A12的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。漿細(xì)胞樣DC（pDC）前體從早期髓樣前體和pre-B前體細(xì)胞分化而來(lái)，與最近在小鼠中相關(guān)研究結(jié)果一致。image.png
6. HSC/MPP分化潛能隨胎齡變化
Fig. 6a & 6b FDG展示各個(gè)階段的HSC/MPP。根部的HSC表達(dá)CLEC9A, HLA-DRA及最高水平的原始基因如MLLT3，為多能的LT-HSC。
Fig.6c-e 來(lái)自CD34 + CD38-CD45RA- HSC / MPP的單細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生單能和多能的細(xì)胞群體。含有紅系細(xì)胞的細(xì)胞群明顯減少，而含有NK細(xì)胞和B細(xì)胞的細(xì)胞群則隨著胎齡的增加而增加。胎齡小于9周時(shí)，無(wú)含B細(xì)胞的群體產(chǎn)生，提示這一階段B細(xì)胞在胎肝中尚未分化。
Fig 6f-6g胎肝HSC / MPP G0期的比例隨著胎齡的增加而增加，表明HSC逐漸趨于沉默狀態(tài)。與臍帶血及骨髓相比，胎肝HSC / MPPs顯示編碼熱休克蛋白（HSPA1A）的基因表達(dá)較高，可能用于維持基因組和蛋白質(zhì)組完整性，而MHC-1（HLA-B）含量較低，表明與抗原呈遞能力較低。
總結(jié)
文章從單細(xì)胞水平，較為全面的構(gòu)造了胎兒肝臟造血圖譜，不僅推測(cè)出HSC/MPP向三系的分化軌跡，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了HSC/MPP內(nèi)部的細(xì)胞異質(zhì)性及成熟度的變化，為研究人類其他器官及組織的發(fā)育軌跡提供了理想模板。
轉(zhuǎn)自單細(xì)胞天地
