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####### 1 reads比對 #######
####### 20220108 #######
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基因組文件：reference.fasta
測序數據文件：example_R1.fq.gz example_R2.fq.gz
1 為參考基因組構建索引
samtools faidx reference.fasta
bwa index reference.fasta
2 將測序數據文件比對到參考基因組
-t 設置線程數,-R 添加reads的標簽信息,view -Sb 將結果文件由sam轉為bam，減少存儲。
bwa mem -t 2 \
-R '@RG\tID:example\tPL:illumina\tSM:example' \
reference.fasta \
./example_R1.fq.gz ./example_R2.fq.gz \
| samtools view -Sb - > example.bam
3 比對結果文件進行排序
-@ 設置線程數，-m 每個線程可使用的最大內存，-o 指定輸出文件名稱
samtools sort -@ 2 -m 10G -o example.sort.bam example.bam
4 去除比對結果中的PCR重復
samtools rmdup -S example.sort.bam example.sort.rmdup.bam
5 過濾比對質量少于20的reads
samtools view example.sort.rmdup.bam -q 20 -O BAM -o example.sort.rmdup.filter.bam
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####### 2 變異檢測 #######
####### 20220108 #######
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基因組文件：reference.fasta
比對結果文件：example.bam
注：GATK3中需要單獨對bam文件進行局部重比對，以提高Indel附近區域比對結果的準確性，但在GATK4中，
局部重比對的步驟已經自動包含在HaplotypeCaller模塊中，無需單獨進行。
1 分別對每個樣品進行變異檢測
用到的GATK模塊為HaplotypeCaller，--java-options 設置JAVA的參數 -XX:+UseSerialGC 單線程運行，-ERC 輸出GVCF
gatk --java-options "-XX:+UseSerialGC"
HaplotypeCaller -R reference.fasta
-ERC GVCF
-I example.bam
-O example.g.vcf.gz
2 對所有樣品的gvcf文件進行合并
用到的GATK模塊為CombineGVCFs, -Xmx400g -Xms400g 指定最大內存，-V 每個樣品的gvcf文件 -O 指定輸出文件名稱
gatk --java-options "-Xmx400g -Xms400g -XX:+UseSerialGC"
CombineGVCFs -R reference.fasta
-V example1.g.vcf.gz -V example2.g.vcf.gz -V example3.g.vcf.gz
-O combine.g.vcf.gz
3 群體變異檢測
用到的GATK模塊為GenotypeGVCFs, -V gvcf文件 -O 指定輸出的vcf文件
gatk --java-options "-Xmx400g -Xms400g -XX:+UseSerialGC"
GenotypeGVCFs -R reference.fasta
-V combine.g.vcf.gz
-O combine.call.vcf.gz
4 提取SNP
用到的GATK模塊為SelectVariants, -select-type 指定提取類型
gatk --java-options "-Xmx400g -Xms400g -XX:+UseSerialGC"
SelectVariants -R reference.fasta
-V combine.call.vcf.gz
-select-type SNP
-O combine.SNP.vcf.gz
4 過濾SNP
用到的GATK模塊為VariantFiltration, --filter-expression 設置過濾參數及閾值
--filter-name 為每個位點添加標記，大于過濾閾值的標記為PASS，否則標記為Filter
gatk --java-options "-Xmx400g -Xms400g -XX:+UseSerialGC"
VariantFiltration -R reference.fasta
-V combine.SNP.vcf.gz
--filter-expression "QD < 2.0 || MQ < 40.0 || FS > 60.0
|| SOR > 3.0 || MQRankSum < -12.5 || ReadPosRankSum < -8.0"
--filter-name "Filter"
-O combine.SNP.filter.vcf.gz
5 提取過濾好的SNP
用到的GATK模塊為SelectVariants，--exclude-filtered 去除被過濾掉的SNP，即標記為Filter的位點
gatk --java-options "-Xmx400g -Xms400g -XX:+UseSerialGC"
SelectVariants -R reference.fasta
-V combine.SNP.filter.vcf.gz
--exclude-filtered
-O combine.SNP.filtered.vcf.gz
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####### 3 變異過濾 #######
####### 20220109 #######
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VCF文件：example.vcf
1 去除Indel附近7bp范圍的SNP
-g 設置距離，單位bp， -O 指定輸出文件格式 v表示未壓縮的vcf文件
注：此步需要vcf文件中包含indel，過濾完后將indel去除
bcftools filter -g 7 -O v -o 1.vcf example.vcf
2 去除10bp范圍內有大于3個SNP的SNP cluster
1 為vcf文件建立索引
gatk IndexFeatureFile -F 1.vcf
2 為符合要求的位點添加標記SNP cluster，-cluster 指定SNP數目 -window 指定窗口范圍，單位bp
gatk VariantFiltration -V 1.vcf -cluster 3 -window 10 -O 2.vcf
3 去除SNP cluster
gatk --java-options "-XX:+UseSerialGC"
SelectVariants -V 2.vcf
-select "FILTER == SnpCluster"
--invertSelect
-O 2.Filtered.vcf
3 將質量值小于20，覆蓋的reads數小于5的基因型設為miss即./.
vcftools --vcf 2.Filtered.vcf
--minDP 5 --minGQ 20
--recode --recode-INFO-all
--out 3.Filtered
4 去除非二等位基因、缺失率大于90%，次要等位基因頻率小于5%的位點
vcftools --vcf 3.Filtered.recode.vcf
--max-allele 2 --min-allele 2
--max-missing 0.9 --maf 0.05
--recode --recode-INFO-all
--out 4.Filtered
5 過濾連鎖不平衡位點
1 轉換vcf文件為ped格式
plink --vcf 4.Filtered.recode.vcf
--allow-extra-chr --recode
--out 5.ld
2 將map文件中的第二列改為每個snp位點特有的標識符
awk '{print 1"_"
3"\t"$4}' 5.ld.map > 5.ld1.map
3 修改相應的ped文件的名稱
mv 5.ld.ped 5.ld1.ped
4 計算位點之間的ld值, --indep-pairwise 設置窗口、步長、r2值
plink --file 5.ld1
--allow-extra-chr
--indep-pairwise 50 10 0.2
--out ld
5 抽出低連鎖的位點，--extract 抽取滿足要求的位點，--make-bed 轉換為bed格式
plink --file 5.ld1
--allow-extra-chr
--extract ld.prune.in
--make-bed --out filter_ld
6 將bed文件轉為vcf文件
plink --bfile filter_ld
--allow-extra-chr
--recode vcf-iid --out filter_ld
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####### 4 系統樹、Admixture和PCA #######
####### 20220109 #######
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VCF文件：example.vcf
BED文件：example.bed
系統樹
1 將SNP轉為fasta格式，用到的軟件為vcf2phylip.py(https://github.com/edgardomortiz/vcf2phylip)
python vcf2phylip.py -f -i example.vcf
2 megacc 構建NJ樹
infer_NJ_nucleotide_NOld.mao為參數文件，常用參數如下：
[ AnalysisSettings ]
Analysis = Phylogeny Reconstruction
Scope = All Selected Taxa
Statistical Method = Neighbor-joining #指定建樹方法
Phylogeny Test = ====================
Test of Phylogeny = Bootstrap method
No. of Bootstrap Replications = 1000 #指定Bootstrap次數
Substitution Model = ====================
Substitutions Type = Nucleotide
Model/Method = p-distance #指定模型
Number of Threads = 4 #指定線程數目
-a 指定參數文件，-d指定序列文件
megacc -a infer_NJ_nucleotide_NOld.mao -d example.fasta -o example_out
3 IQTREE 構建ML樹
-s 指定序列文件，-o 指定外類群名稱， -T 指定線程數目，-B 指定Bootstrap次數，-m MFP 自動搜索最適合模型并建樹
iqtree -s example.fasta -o acoe -T 10 -B 1000 -m MFP
Admixture
1 依次計算K=2到K=20
for k in {2..20} ;do admixture --cv=10 example.bed {k}.out; done
2 處理admixture結果
1 提取出Q文件中的個體順序
awk '{print $2}' example.fam > ID
2 給Q文件添加個體id
for i in *Q ;do paste ID i.id ;done
3 按照sortID文件中的指定順序，給Q文件排序
for i in *id ;do python3 sortQ.py sortID i.sort ;done
3 繪圖
a <- read.table("sort.5k",row.names = 1)
b <- t(as.matrix(a))
b.reverse <- b[,324:1]
p <- barplot(b.reverse,space = 0,border = NA,axisnames = F,
col = c("gold","firebrick","DarkGoldenrod4","IndianRed1",))
axis(side = 1, p, labels = F, at = c(0:324))
labs <- colnames(b.reverse)
text(cex=.3, x=p-0.25,y=-0.05,labs,xpd=TRUE,srt=45,adj = c(1,1))
PCA
--pca 324 計算324個PC的值，324為輸入文件中的個體數
plink --allow-extra-chr --bfile example --pca 324
