轉載自：https://blog.csdn.net/yangl7/article/details/109202042

一、BWA比對

1.構建索引

bwa index -a is example.fasta #構建索引 -a is算法 （BWT構造算法：bwtsw、is或rb2）

2.進行比對

bwa mem -t 6 -R '@RG\tID:foo\tPL:Illumina\tSM:example'

example.fasta example_1.fq.gz example_2.fq.gz > example.sam

# 進行對比 mem算法 -t 運行的核數目

# -R添加頭部?

ID：這是Read Group的分組ID，一般設置為測序的lane ID（不同lane之間的測序過程認為是獨立的），下機數據中我們都能看到這個信息的，一般都是包含在fastq的文件名中；

PL：指的是所用的測序平臺，這個信息不要隨便寫，在GATK中，PL只允許被設置為：ILLUMINA，SLX，SOLEXA，SOLID，454，LS454，COMPLETE，PACBIO，IONTORRENT，CAPILLARY，HELICOS或UNKNOWN這幾個信息。如果不知道，那么必須設置為UNKNOWN。

SM：樣本ID。

LB：測序文庫的名字，如果上面的lane ID足夠用于區分的話，也可以不用設置LB；

（用GATK檢測變異 其中ID,PL和SM信息是必須的）

二、samtools格式轉換

1.sam格式轉換為bam格式

samtools view -bS example.sam -o example.bam

# -b 輸出bam格式文件 -S 輸入sam格式文件

2.質控

samtools view -h -b -q30 example.bam > example.q30.bam

# -q 比對的最低質量值 -h 輸出的文件包含頭部信息 -b 輸出bam格式文件

3.構建索引

samtools faidx base/example.fasta

# 該命令會在example.fasta所在目錄下創建一個example.fai索引文件

gatk CreateSequenceDictionary -R example.fasta -O example.dict

# 創建gatk索引 生產dict文件

三、gatk變異檢測

1.排序

gatk SortSam -I example.q30.bam -O example.q30.sort.bam

-R base/example.fasta -SO coordinate --CREATE_INDEX true

# -I 輸入文件 -O 輸出文件 -R參考基因組 --CREATE_INDEX 是否建立索引

將sam文件中同一染色體對應的條目按照坐標順序從小到大進行排序

2.標記重復序列

gatk MarkDuplicates -I example.q30.sort.bam -O example.q30.sort.markdup.bam -M example.q30.sort.markdup_metrics.txt

# -I 輸入排序后的文件 -O 輸出文件 -M 輸出重復矩陣

注意：

samtools index example.q30.sort.markdup.bam

# 為gatk建立索引這里非常重要

3.檢測變異

gatk HaplotypeCaller --emitRefConfidence GVCF -R base/example.fasta -I example.q30.sort.markdup.bam -L chrX -O chrX.g.vcf.gz

# HaplotypeCaller同時檢測snp和indel -R 參考基因組 -I 輸入文件 -L 僅檢測該染色體的變異（分染色體檢測變異，加快速度）-O 輸出文件

這里分染色體進行檢測，后續再進行合并，可以加快檢測速度。

合并文件(g.vcf)

gatk CombineGVCFs -R base/example.fasta --variant example1.g.vcf.gz --variant example2.g.vcf.gz -O con.vcf.gz

# -R 參考基因組 --variant 輸入變異文件 可以輸入多個文件 -O 輸出文件

檢測變異

gatk GenotypeGVCFs -R ref.fa -V test.g.vcf -O test.vcf

4.提取SNP變異

gatk SelectVariants -R base/example.fasta -V test.vcf -O test.snp.vcf --select-type-to-include SNP

# -R 參考基因組 -O 輸出vcf文件 -V 輸入vcf文件 --select-type-to-include 選取提取的變異類型(#SNP,MNP,INDEL,SYMBOLIC,MIXED)

5.對SNP進行過濾

gatk VariantFiltration -O chr5.Filt.vcf -V chr5.vcf

--cluster-window-size 10

--filter-expression "MQ0 >= 4 && ((MQ0 / (1.0 * DP)) > 0.1)" --filter-name "HARD_TO_VALIDATE"

--filter-expression "DP < 5 " --filter-name "LowCoverage"

--filter-expression "QUAL < 30.0 " --filter-name "VeryLowQual"

--filter-expression "QUAL > 30.0 && QUAL < 50.0 "

--filter-name "LowQual" --filter-expression "QD < 1.5 "

--filter-name "LowQD"

# -O 輸出文件 -V輸入變異文件 --filter-expression 過濾條件 --filter-name 被過濾掉的SNP不會刪除，而是給一個標簽，例如 "LowCoverage" 。

這里可以將過濾條件合并，僅給出一個標簽。--cluster-window-size 以10個堿基為一個窗口

這里通過設定相應的參數值進行了硬過濾，實際應用時還要根據數據類型及自己的需求設定相應的參數。

6.合并文件(vcf)

刪除掉被過濾的SNP

grep -v "LowCoverage" Filt.vcf > Filt1.vcf

# -v顯示不包含匹配文本的所有行 "LowCoverage"上一步給出的標簽

合并成一個文件

gatk MergeVcfs -I chr1.Filt.vcf -I chr2.Filt.vcf -I chr3.Filt.vcf? -O Filt.vcf

# -I 輸入文件 可以多次指定 -O 輸出文件

至此為止就得到了整個群體的VCF變異文件，后續都是基于此文件來進行相應的分析。

四、Plink格式轉換及主成分分析

1.VCF格式轉換為 ped/map格式

vcftools --vcf snp.vcf --plink --out snp

2.ped/map格式轉換為bed/bim/fam格式

plink --file snp --make-bed --out snp_test

3.主成分分析

Plink --threads 8 --bfile snp --pca 10 --out pca

# --threads 線程數 --bfile 輸入.bed文件 --pca 主成分的成分數 --out輸出的文件名

五、Admixture 群體結構

1.群體結構分析

for K in 2 3 4 5 6 7 8 9 10; \

do admixture --cv hapmap3.bed $K | tee log${K}.out; done

#2 3 4 5 6 7 8 9 10分成的群體結構數 hapmap3.bed 輸入文件

注意:

如果你的數據格式是plink的bed文件, 比如a.bed, 那么你應該包含a.bim, a.fam

如果你的數據格式是plink的ped文件, 比如b.ped, 那么你應該包括b.map

K值根據實際情況進行設置，通過比較得到最佳K值。

grep -h CV log*.out

#查看最佳K值 輸出最佳K值文件：hapmap3.3.Q

2.R語言作圖

tbl=read.table("hapmap3.3.Q")

barplot(t(as.matrix(tbl)), col=rainbow(K),

xlab="Individual", ylab="Ancestry", border=NA)

hapmap.3.Q文件為群體結構的結果，作為協變量進行關聯分析

六、Tassel關聯分析

Tassel的管道命令不允許有回車符號，使用以下命令時需要將#注釋及換行刪除。

1.VCF格式轉換為 hmp格式

run_pipeline.pl -SortGenotypeFilePlugin -inputFile example.vcf -outputFile example -fileType VCF

#給vcf文件排序，排成tassel認可的序列

#-inputFile 輸入的文件名 -outputFile 輸出的文件名 -fileType 輸出的文件格式

run_pipeline.pl -fork1 -vcf example.vcf? -export example -exportType Hapmap -runfork1

#vcf文件轉換為hapmap格式

#-vcf 輸出的文件 -export 輸出的文件 -exportType 輸出的文件格式

2.親緣關系

run_pipeline.pl -importGuess genotype.hmp.txt #打開數據文件

-KinshipPlugin -method Centered_IBS -endPlugin #計算親緣關系

-export genotype_kinship.txt? #輸出文件名

-exportType SqrMatrix #輸出格式

3.關聯分析

混合線性模型

run_pipeline.pl -fork1 -h genotype.hmp.txt -filterAlign -filterAlignMinCount 150 -filterAlignMinFreq 0.05 -filterAlignMaxFreq 1

#-h讀取hapmap格式的基因型數據 -filterAlign 打開過濾選項

#-filterAlignMinCount -filterAlignMinFreq -filterAlignMaxFreq 過濾的條件 需要按照實際情況進行修改

-fork2 -r traits.txt

#-r 讀取表型數據

-fork3 -q population_structure.txt -excludeLastTrait

#-q 讀取群體結構數據 -excludeLastTrait 去掉最后一個群體結構 （當分成的群體結構＞2時）

-fork4 -k kinship.txt

#讀取親緣關系數據

-combine5 -input1 -input2 -input3 -intersect -combine6 -input5 -input4 -mlm -export example

#-combine合并數據 -mlm混合線性模型 -export輸出文件名

一般線性模型

run_pipeline.pl

-fork1 -h genotype.hmp.txt -filterAlign

-filterAlignMinCount 150 -filterAlignMinFreq 0.05 -filterAlignMaxFreq 1

-fork2 -r traits.txt

-fork3 -q population_structure.txt -excludeLastTrait

-combine4 -input1 -input2 -input3 -intersect -glm -export example

#-glm 一般線性模型

4.R語言作圖

Library(qqman)

#加載qqman包

曼哈頓圖

manhattan(example,ylim=c(0,10),col = color_set,annotatePval = 0.01)

# ylim Y軸范圍 col 顏色 annotatePval 標記最高位點 CHR==1 繪制每個染色體的曼哈頓圖

Q-Q plot

qq(example$P)

七、其他

1.基因組統計工具

可以統計fasta和fastq文件中的信息。

seqkitfx2tab example.fasta -l -n

-l統計序列長度 -n 統計染色體

2.提取文本文檔中某列

用于Tassel關聯分析后的結果文件，提取相應的列進行R語言繪圖。

catMLM.txt | awk '{print $1" "$3" "$4" "$7}' > manhattan.txt

# $提取的列數

3.刪除文本文檔中不包含匹配文本的行

用于過濾后刪除低質量的SNP。

grep-v"LowCoverage"Filt.vcf > Filt1.vcf