hello，大家好，這一篇我們要看一下單核轉錄組和空間轉錄組的聯合分析，參考文章在Transcriptomic Profiling Reveals Cancer-Associated Fibroblasts as Potential Targets for the Prognosis and Treatment of Cervical Squamous Cell Carcinoma，其實最主要的目的就是在于了解單核轉錄組與空間轉錄組的聯合分析及運用。

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ABSTRACT

為了了解宮頸鱗狀細胞癌 (CSCC) 的病因、結構和免疫學特征，對來自 20 個人的宮頸樣本進行了單核 RNA 測序 (snRNA-seq) 和空間轉錄組學 (ST) 實驗。在探索影響 CSCC 個體內免疫異質性的可能因素時，確定了一組在某些腫瘤周圍富集的癌癥相關成纖維細胞 (CAF)，它們高度表達 ACTA2、POSTN、ITGB4 和 FAP。結果表明，CAFs可能通過抑制淋巴細胞浸潤和重塑腫瘤細胞外基質來支持腫瘤的生長和轉移。此外，高 CAF 信號預測 CSCC 患者的臨床結果較差。數據還揭示了 HPV 在腫瘤中的感染情況、參與宮頸癌病變進展的關鍵因素以及腫瘤代謝與免疫反應強度之間的關聯。總的來說，研究結果可能會改善 CSCC 的預后和治療方法。

INTRODUCTION

Cervical cancer is the fourth most common cancer affecting women’s health globally, especially in low- and middle-income regions. Since 2018, the World Health Organization (WHO) has called for the global elimination of cervical cancer, quantifying actions in vaccination, screening, and disease treatment/management，which require joint efforts from different parties for decades（這一段大家了解即可）.

Currently, over 12 types of human papillomaviruses (HPVs) are carcinogenic 。 其中，HPV16占宮頸癌病例的60%-70%，尤其是宮頸鱗狀細胞癌（CSCC）。 HPV 編碼三種癌蛋白，包括 E5、E6 和 E7，它們可以破壞細胞周期并導致不受控制的細胞分裂。 CSCC的發展一般要經歷低級別鱗狀上皮內病變（LSIL）、高級別鱗狀上皮內病變（HSIL）和浸潤性宮頸癌，這可能需要幾十年的時間。 CSCC 的腫瘤微環境 (TME) 是由病毒、癌細胞、基質細胞和免疫細胞之間復雜的相互作用形成的，但由于技術限制和缺乏研究，尚未完全表征。 破譯推動疾病進展的因素可能會產生新的預后和干預策略。

早期宮頸癌行根治性子宮切除術雖然可以獲得良好的預后，但晚期宮頸癌的5年總生存率或無病生存率均不盡如人意。目前，化療（如紫杉醇、順鉑、貝伐珠單抗等）和放療仍是轉移或復發患者的主要姑息治療策略，反應率低（48%），生存期短（17個月）.免疫療法通過逆轉疲憊或受抑制的免疫活動，為治療無法治愈的宮頸癌帶來新希望。針對程序性細胞死亡 1 (PD1)、程序性細胞死亡配體 1 (PD-L1) 和細胞毒性 T 淋巴細胞抗原 4 (CTLA4) 的免疫檢查點阻斷 (ICB) 藥物目前正在試驗中用于治療復發性/轉移性宮頸癌。不幸的是，ICB 治療的總體反應率很低，從 4% 到 26% 不等。闡明 CSCC 的免疫狀況，尤其是 TME 中的免疫抑制狀態，可能有助于我們更好地解決這一現象并調整我們對宮頸癌的治療策略。

單細胞測序和空間轉錄組學 (ST) 是揭示腫瘤細胞異質性和微環境的最先進工具，但此類技術在 CSCC 研究中的應用仍然很少。 在這項研究中，收集了 20 個人的宮頸樣本，并結合單核 RNA 測序 (snRNA-seq) 和 ST 來研究病因、結構 和 CSCC 的免疫學特征。 破譯 HPV 誘導的 CSCC 的轉錄組變化將為 CSCC 的診斷、預后和治療提供新的見解。

RESULTS

snRNA-seq data revealed the cellular composition of CSCC

為了充分表征宮頸組織的細胞組成，收集了 5 名患者的 CSCC 樣本進行 snRNA-seq。共有67,003個細胞和30,996個基因通過質控，根據經典細胞標志物從中鑒定出14種細胞類型，包括癌細胞（6,960）、柱狀上皮細胞（CECs，22,396）、內皮細胞（6,340）、平滑肌細胞(4,502)、成纖維細胞 (9,836)、B 細胞 (689)、單核細胞 (5,281)、T 細胞 (4,930)、調節性 T (Treg) 細胞 (1,081)、漿細胞 (3,236)、髓樣樹突細胞 (DC) (955 )、漿細胞樣 DC (272)、肥大細胞 (384) 和自然殺傷 (NK) 細胞 (141)。子宮頸包含兩種類型的細胞在其表面排列，子宮頸外層為復層鱗狀上皮細胞，子宮頸內膜和隱窩上有簡單的柱狀上皮細胞。鱗狀上皮細胞的發育不良導致 CSCC。因此，癌細胞主要表達已知的CSCC相關基因SERPINB3（Serpin Family B Member 3），鱗狀細胞的腫瘤基因TP63、CDKN2A和角蛋白基因KRT15。由于組織主要來自晚期癌癥患者（FIGO IB2-IIIC1期；在化療前宮頸活檢期間收集沒有分期信息的組織），因此很少分離出正常的上皮鱗狀細胞。 snRNA-seq counts與高風險 HPV 參考基因組的映射揭示了癌細胞中病毒基因的存在。還鑒定了一大群柱狀上皮細胞，它們高度表達 MUC5B 和 WFDC2。這種細胞類型主要位于子宮頸內皮上皮，但也可以出現在成人子宮頸和一些腺體的鱗柱交界處。平滑肌細胞、成纖維細胞和內皮細胞是構成宮頸間質的主要細胞類型。平滑肌細胞高表達MYH11、MYLK、ACTG2、COL3A1和COL1A1，成纖維細胞除COL3A1和COL1A1外還高表達LAMA2，而內皮細胞可通過EMCN、FLT1和EGFLT的高表達來區分。除了子宮頸的結構細胞外，還鑒定了多種免疫細胞類型，其中單核細胞（ITGAX、MX4A7）、T細胞（CD3E、CD247）和漿細胞（MZB1、IGKC）最為豐富。簡而言之，snRNA-seq 數據提供了一個全面的圖譜，顯示了 CSCC 組織的結構和免疫細胞組成（細胞marker注意搜集一下）。

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Spatial transcriptomic characterization of CSCC

空間信息對于理解組織中的細胞間相互作用至關重要，不幸的是，這在 snRNA-seq 數據中被忽略了。因此，利用 SpaTial Enhanced REsolution Omics-sequencing (Stereo-seq) 技術來獲取原位基因表達譜。獲得了來自 2 名非癌癥患者和 14 名 CSCC 患者的宮頸樣本，并將其嵌入 OCT。從每個 OCT 塊中解剖出 10 μm 厚的連續冷凍切片，用于立體測序、蘇木精和伊紅 (HE) 染色以及免疫組織化學 (IHC) 染色。最后，共成功獲得 18 張 ST 載玻片（非癌，n=3；CSCC，n=15）。 Stereo-seq 芯片中的捕獲點直徑為 220 nm，兩個相鄰點之間的中心距為 500 nm。捕獲spot被分組到箱中以包含足夠的基因以進行準確的聚類。初步分析顯示，腫瘤區域的 RNA 豐度比基質區域高得多。為了平衡腫瘤和基質之間的表達差異，在 bin（100 x 100 點）處對 CSCC ST 載玻片進行了注釋，以充分展示組織成分，其覆蓋面積約為 49.72 x 49.72 μm。 CSCC ST 載玻片的每個 bin 的平均基因數介于 1,767 到 4,152 之間。由于來自非癌癥患者的三張 ST 載玻片的基因表達強度低于 CSCC 載玻片，因此它們在 bin200 (99.72 x 99.72 μm) 處進行了注釋。統一流形近似和投影 (UMAP) 分析表明，CSCC 和非癌癥的 bin cluster傾向于彼此分離，而 CSCC 的 bin cluster則顯示出一些收斂。

考慮到癌組織的復雜結構，根據專業病理評估（基于HE和IHC染色結果）和標記基因表達模式手動進行了ST載玻片的初始注釋。在分析的 CSCC 樣本中，通常鑒定出六種類型的組織cluster，包括腫瘤、間質（無明顯炎癥）、炎癥（間質具有彌漫性炎癥或局灶性炎癥）、腺體、血管和壞死。腫瘤、基質和炎癥cluster廣泛分布在 CSCC 樣本的 ST 載玻片中，某些樣本包含壞死、腺體和血管。根據基因表達譜，組織cluster可以進一步分為帶有數字后綴的subcluster。應該記住，ST cluster實際上是一個定義區域內的小區的混合物，但由其主要特征指定。例如，腫瘤cluster不完全由癌細胞組成，也可能包含其他細胞類型，但數量很少，如免疫細胞、成纖維細胞等。組織特異性基因也顯示出空間模式。 KRT5、CDKN2A、SERPINB3等癌性鱗狀細胞相關基因主要富集在ST腫瘤區，IGKC和IGLC2主要富集在炎癥區，VIM在間質區，ADRA2A在血管中，MUC5B在腺體中富集。一般而言，在 ST 腫瘤區域中觀察到的轉錄和翻譯活性、細胞增殖、氧化磷酸化和免疫反應高于其他區域。 ST 載玻片的初始手動注釋用于輔助 TME 的下游分析。

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關于HPV的病因學作用，病毒基因在宮頸組織中的表達一直是人們感興趣的話題。 將 ST 測序讀數與 HPV 參考基因組作圖，發現捐獻 15 個樣本的所有 14 名 CSCC 患者均為 HPV 陽性，其中 85.7%（12/14）被 HPV16 感染，7.1%（1/14）被 HPV33 感染，并且 HPV58 為 7.1% (1/14)。 HPV 讀數覆蓋了病毒基因組的 8% - 100%（約 600 bp - 7905 bp），主要在 ST 腫瘤區域被識別。 空間可視化展示了同一樣本不同腫瘤部位病毒基因的不同捕獲信號，包括 E5、E6、E7、和 L1 經常觀察到。 In contrast, only marginal HPV reads were identified in the non-CSCC samples 。

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ST data resolved the evolutionary trajectory of CSCC（空間進化軌跡）

由于 ST 數據能夠揭示同一組織切片內不同腫瘤區域的空間分布，這為研究 CSCC 的進化軌跡提供了機會。高級別上皮內瘤變、原位癌和浸潤癌代表宮頸的不同病理狀態，它們經常同時發生在同一患者身上。然而，由于技術限制，同一個人內這些病理過程的動態變化仍然模糊不清。在這里，首先通過計算其 CytoTRACE 評分（關于CytoTRACE，大家可以參考我的文章10X單細胞軌跡分析（擬時分析）之cytotrace，非常棒的方法）來評估 ST 載玻片中每個腫瘤亞群的分化狀態。同時使用 HE 染色來識別宮頸上皮及其相鄰腫瘤區域。癌性上皮區被認為是浸潤前癌病灶，而鄰近腫瘤區域的CytoTRACE評分相對較高，表明分化程度相對較低，被認為是浸潤性癌病灶。由于遠離上皮的腫瘤的轉移路徑難以確定，因此該分析不包括此類腫瘤區域。最后，確定了來自獨立患者的兩個樣本（TJH37 和 TJH90），其中包含侵襲前和侵襲性病變。cluster 14 和 16 被識別為侵襲前病變，而cluster 12 和 13 分別被確定為 TJH37 和 TJH90 的侵襲性病變。

基于侵襲前病變與侵襲性病變（Log 2FC > 0.5 或 Log 2FC < -0.5，P < 0.001）的差異表達基因（DEGs）的功能分析表明，上調基因主要參與皮膚發育、角質形成細胞分化、 對傷口和細菌的反應、維生素 D 受體 (VDR) 通路、血管發育和中性粒細胞脫顆粒，主要與分化和對有害刺激（如 HPV 感染、上皮損傷）的反應增強有關。 相比之下，下調的基因與 RNA 代謝、氧化磷酸化、線粒體組織、細胞呼吸和病毒 mRNA 翻譯顯著相關，表明侵襲性癌癥病變中的代謝增加。 VDR 通路在侵襲前病變中的積極參與值得注意，這表明其在宮頸粘膜免疫中的重要作用。

然后，試圖查明參與癌性病變進展的關鍵基因。兩個樣品共有 16 個 DEG（Log2FC > 1.0 或 Log2FC < -1.0，P < 0.001）。偽時間分析表明，12個基因（ANXA1、AL136982.6、CRCT1、S100A7、S100A9、SPRR1A、SPRR1B、SPRR2A、SPRR2D、SPRR2E、KRTDAP和KRT17）被其他浸潤前癌病變基因過表達（而CD74、MT2A、KRT5 和 KRT15) 往往被侵襲性病變過度表達。由于早期預后對于宮頸上皮內瘤變 (CIN) 患者的分類至關重要，我們很好奇這些 DEG 是否具有任何臨床價值。我們從基因表達綜合（GEO）數據庫中下載了 GSE63514 數據集，其中包含 66 個宮頸浸潤前（CIN）和 38 個浸潤性病變（宮頸癌）樣本，并進行 PCA 分析以驗證 DEG 的區分能力。結果表明，11個DEGs的組合（其余5個基因在該數據集中未鑒定）可以很好地區分浸潤前（CIN）和浸潤性病變（宮頸癌）。隨機森林 (RF) 測試顯示這 11 個基因（ANXA1、S100A9、S100A7、KRT15、SPRR1A、SPRR1B、CD74、KRTDAP、MT2A、CRCT1 和 KRT5）具有相似的重要性。 RF 分類模型也表現出良好的性能，在 10 次測試中達到了 0.848 的平均 AUC（ROC 曲線下面積）。總之，這些 DEG 可能為 CIN 和癌癥之間的鑒別診斷提供新的見解。

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Variable immune inhibition in CSCC（免疫抑制）

關于 ICB 治療宮頸癌的低反應率，決定仔細檢查 CSCC 的免疫狀況以尋找線索。在 snRNA-seq 和 ST 數據中評估了具有不同免疫功能的三個基因組的表達譜，即共刺激、細胞毒性/效應子和共抑制/耗竭。在單細胞水平上，共刺激基因在先天免疫和適應性免疫細胞中均有表達，尤其是在 Treg、T 和 NK 細胞中。發現 Treg 細胞高度表達 CD27、CD28、CD40LG、ICOS、TNFRSF18、TNFRSF4 和 TNFRSF9。雖然這些基因是 Treg 細胞成熟和正常抑制功能所必需的，但 Treg 細胞中 CD27 的過度表達可能會抑制抗腫瘤免疫反應。在空間上，共刺激基因傾向于在腫瘤和炎癥區域富集。特別是，TNFRSF18（也稱為糖皮質激素誘導的TNF受體，GITR）在炎癥和腫瘤區域中普遍表達。然而，其在非癌癥樣本的上皮細胞中的表達也上調。在snRNA-seq 數據中，該基因主要在 Treg、NK、T 細胞和肥大細胞中檢測到。雖然TNFRSF18與腫瘤中Treg細胞的免疫抑制有關，但其高空間表達水平可能是由多種類型的免疫細胞共同貢獻的。免疫細胞毒/效應基因主要由 T 和 NK 細胞表達，其中一些在 ST 載玻片的炎癥和腫瘤區域通常上調，包括 GNLY、GZMA、GZMB 和 NKG7。這些基因主要由 NK 細胞表達，表明 NK 細胞在針對 CSCC 的細胞毒性反應中起著不可或缺的作用。對于共抑制/耗竭基因，我們未能在我們的 ST 數據中檢測到 CTLA4 和 PD-1 的任何顯著表達，盡管 Treg 細胞可以高度表達 CTLA4，Treg、T 和 NK 細胞可以高度表達 PD-1。 PD-L1 主要由漿細胞樣 DCs 表達，僅在一小部分 ST 樣本的腫瘤或炎癥區域過度表達。雖然 CD276、ENTPD1、IDO1、LGALS9 和 VSIR 通常在 ST 樣本中檢測到，但與非癌癥樣本相比，只有 IDO1 和 LGALS9 在 CSCC 樣本中似乎具有更高和更廣泛的表達。這兩個基因都由 DC 表達，并且可以下調細胞毒性 T 細胞的活性。 IDO1 和 LGALS9 是否可以成為比 CTLA4 和 PD-L1 更好的 ICB 治療 CSCC 的靶點仍有待探索。此外，當我們放大檢查同一ST載玻片中的免疫基因時，它們的表達在不同腫瘤區域之間可能會有很大差異。在樣本 TJH08 中，腫瘤通常表達高 IDO1、低 PD-L1 和非常低的 CTLA4。相比之下，樣本 TJH37 中只有一個腫瘤區域表達這些基因?？偟膩碚f，盡管我們的 snRNA-seq 和 ST 數據都顯示了 CSCC 患者免疫衰竭的證據，但患者之間和患者內部的免疫微環境差異很大。

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Hypermetabolic tumors were associated with low immune response

代謝可以調節腫瘤的免疫微環境，這可能是癌癥治療的推定干預目標。分別對六個途徑進行了基因集變異分析 (GSVA)，包括缺氧、乳酸、糖酵解、脂質代謝、磷酸戊糖和氧化磷酸化途徑。然后將上述六種途徑的 GSVA 評分的平均值計算為每個腫瘤區域的代謝評分。根據 GSVA 代謝評分，排名前 20 位的 ST 腫瘤cluster被歸類為高代謝腫瘤，而那些排名最后 20 位的為低代謝腫瘤。一般來說，高代謝腫瘤在氧化磷酸化、糖酵解和乳酸途徑中表現出更高的活性，表明增殖的癌細胞中存在活躍的有氧糖酵解，即 Warburg 效應。此外，高代謝腫瘤還伴隨著嚴重的缺氧和活躍的脂質代謝，表明快速生長的腫瘤存在強烈的氧化和營養應激。進一步觀察到代謝和免疫反應之間的負相關。發現高代謝腫瘤經歷了較低水平的適應性和先天免疫干擾、淋巴細胞浸潤和淋巴管生成。根據每個 bin（100 x 100 個點）中的基因模塊表達評分進一步探討了腫瘤分化、缺氧和免疫之間的關系。較低的腫瘤分化水平（由較高的 CytoTRACE 評分表示）與較嚴重的缺氧呈正相關（r = 0.28，P < 0.001）。此外，缺氧與適應性免疫呈負相關（r = -0.19，P < 0.001），尤其是淋巴細胞浸潤（r = -0.22，P < 0.001）。值得注意的是，Th1細胞（r = -0.17，P < 0.001）、B細胞（r = 0.30，P < 0.001）、未成熟B細胞（r = -0.18，P < 0.001）和肥大細胞（r = -0.22, P < 0.001) 在缺氧腫瘤中顯著降低。雖然缺氧對先天免疫評分沒有顯著影響，但在缺氧的腫瘤中發現 CD56-NK 細胞增加（r = 0.27，P < 0.001）和未成熟的樹突狀細胞（r = 0.23，P < 0.001），這可能無法有效對抗癌細胞。進一步嘗試分別使用 TOP2A 和 PTPRC 作為增殖細胞和免疫細胞的標志物在空間上驗證代謝和免疫之間的相關性。在樣本 TJH34 和 TJH35 中，能夠在同一 ST 載玻片中識別高代謝和低代謝腫瘤區域。在低代謝腫瘤區域內外檢測到更高的 PTPRC 表達，與 HE 圖像中的淋巴細胞分布模式一致。這些觀察結果表明，由活躍增殖的腫瘤引起的氧氣和營養缺乏環境可能會阻止 B 細胞、肥大細胞以及功能性 DC、NK 細胞和輔助 T 細胞的積累?？偟膩碚f，分化差的腫瘤往往代謝更活躍，這可能導致缺氧和缺乏免疫干預。

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Identification of a cluster of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in CSCC

在探索樣本 TJH34 中高代謝和低代謝腫瘤區域之間的免疫差異時，注意到高代謝腫瘤區域外有一個獨特的空間cluster。這個cluster不同于大多數間質cluster，看起來像一條包裹著腫瘤的絲帶。分析認為這個特定的cluster可能對塑造腫瘤區域之間的免疫異質性至關重要。由于該cluster是基質的一部分，仔細檢查了 snRNA-seq 數據中的成纖維細胞。幸運的是，鑒定了來自所有五個樣本的一小組成纖維細胞，它們高度表達了 CAF 的報告標記基因，包括 ACTA2、POSTN、ITGB4 和 FAP。 CAFs 的干細胞評分低于癌細胞和成纖維細胞，并且處于不同的細胞周期階段。基于標志基因集（MSigDB v7.4，https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/）的功能富集表明CAF與成纖維細胞和癌細胞具有共同的活動。 CAF 參與成纖維細胞的類似途徑，包括紫外線反應減弱、血管生成、肌生成和上皮-間質轉化。對于包括 p53 通路、KRAS 信號轉導、雌激素反應、有絲分裂紡錘體、G2/M 檢查點和 E2F 目標在內的通路，CAF 顯示出與癌細胞相似的活性。在基因水平，CAFs不僅高表達成纖維細胞的標志基因，如膠原蛋白家族（COL1A1、COL3A1、COL4A1、COL5A2、COL6A3等），還高表達惡性鱗狀細胞的標志基因，如KRT4和KRT13角蛋白家族的。盡管癌癥中的 CAFs 可能有不同的起源，但上皮特征表明 CSCC 樣本中 CAFs 的起源可能與 EMT 相關。

為了定位 CSCC 組織中 CAF 的空間分布，采用了 Moncada 等人開發的多模態交叉分析 (MIA) 方法，整合snRNA-seq和ST數據（關于MIA的方法，大家可以參考我的文章MIA用于單細胞和空間的聯合分析）。簡而言之，該方法計算了由snRNA-seq數據識別的細胞類型特異性基因與由ST數據表征的區域特異性基因的表達水平的重疊程度。由此產生的 p 值越小，在后面的描述中被稱為 MIA 分數，定義的細胞類型和 ST 區域之間的相關性就越強。初始 MIA 結果表明，ST 聚類結果符合相應區域的預期細胞組成。不幸的是，單獨的 MIA 分數不能完全反映細胞的空間特異性，尤其是在 RNA 豐度低的區域。因此，同時利用經實驗證實與 CAF 相關的 POSTN 的高表達水平和 CAF 的高 MIA 分數來定義 CAF 的 ST cluster。結果表明，CAFs 在 ST 載玻片中的一些腫瘤區域周圍富集，包括樣本 TJH34 的高代謝腫瘤區域。通過使用相同樣本的連續組織切片對 POSTN 進行 IHC 染色，進一步證實了 CSCC 中 CAF 的存在。值得注意的是，并非所有腫瘤區域都被 CAF 包圍，這讓我們對與這些細胞存在相關的生物學差異感到好奇。

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CAFs might facilitate the growth and metastasis of CSCC from diverse aspects

為了全面揭示 CAFs 在 CSCC 中的生物學功能，將 ST 載玻片中的腫瘤區域分為兩種類型：CAFs 包圍的腫瘤區域（CAFs+腫瘤）和未被 CAFs 包圍的腫瘤區域（CAFs-腫瘤）。 發現三張 ST 載玻片包含 CAFs⁺ 和 CAFs^- 腫瘤區域，并用于下游分析。 然后使用這3個樣本的CAFs+和CAFs-腫瘤區域之間上調和下調的DEG進行GO富集分析。 結果表明，CAFs⁺腫瘤在能量使用、代謝、有絲分裂和細胞生長方面比CAFs^-腫瘤更活躍。 同時，細胞粘附、凋亡和免疫反應在 CAFs⁺ 腫瘤中下調。 上述觀察結果與 CSCC 的免疫和代謝異質性非常吻合，尤其是在樣品 TJH34 中。 這些表明CAFs的存在可以從不同方面支持腫瘤進展。

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作為基質的一部分，CAF 必須與癌細胞、基質細胞和免疫細胞密切相互作用。事實上，對 snRNA-seq 數據的分析表明，CAF 與其他細胞之間在細胞外基質 (ECM) 形成和細胞-細胞接觸方面存在復雜的相互作用。 CAFs 高表達膠原家族基因，特別是 COL1A1、COL1A2、COL4A1、COL4A2、COL4A5、COL6A1、COL6A2 和 COL6A3）與免疫細胞和平滑肌細胞表達的 CD44 相互作用，可能參與細胞粘附和遷移。膠原蛋白還與由癌細胞、免疫細胞和基質細胞表達的整合素家族的不同成員相互作用。同樣，由 CAF 表達的 FN1（纖連蛋白 1，一種可溶性糖蛋白）和層粘連蛋白（LAMA2、LAMA3、LAMA4、LAMA5、LAMB1、LAMB2、LAMB3、LAMC1、LAMC3）也通過整合素與其他細胞類型相互作用。整聯蛋白是由 α 和 β 亞基組成的膜受體蛋白，參與細胞粘附和識別。有趣的是，CAF 使用不同的異二聚體形式的整聯蛋白來接觸其他細胞類型。它們可能通過由α2β1、α3β1和αvβ8亞基組成的整合素與癌細胞相互作用，同時通過由α9β1、α6β1和α1β1亞基組成的整合素與內皮細胞、CEC、平滑肌細胞相互作用，并通過與T細胞和NK細胞相互作用。由亞基 α1β1 組成的整合素。重要的是，CAF 可以利用 F11R（也稱為 JAM1，連接粘附分子 1）通過 F11R 和 JAM3 與癌細胞和基質細胞形成緊密連接，這可能會阻止免疫細胞的浸潤。 CAF 還可能表達其他基質蛋白，包括 THBS1（血小板反應蛋白 1）、THBS2 和 TNC（生腱蛋白 C），以通過 CD44、整合素（α3β1）和 SDC1 與免疫細胞、平滑肌細胞、癌細胞和漿細胞進行交流。此外，CAF 過度表達了幾種組織重塑因子，包括 POSTN（骨膜蛋白，一種分泌的細胞外基質蛋白）、FAP（成纖維細胞活化蛋白，一種絲氨酸蛋白酶）、MMP1（基質金屬蛋白酶 1）、TNC（肌腱蛋白-C，一種基質蛋白）、和 LOXL1（賴氨酰氧化酶 1，催化膠原蛋白和彈性蛋白的交聯）。這一證據表明 CAF 在塑造腫瘤細胞外環境中的關鍵作用。

除了在 ECM 構建中的作用外，CAF 還可以通過過度表達分泌因子（包括 SEMA3C、POSTN、CXCL6）來增強癌細胞的干性和增殖。據報道，SEMA3C 可促進癌癥干細胞維持、血管生成和侵襲 36,37。 POSTN 可以通過整合素 αvβ3 激活 Akt/PKB 通路來增加癌細胞的存活率。它還可能通過 PTK7-Wnt/β-Catenin 信號通路促進癌癥生長。 CXCL6（C-X-C 基序趨化因子配體 6）雖然主要與免疫反應有關，但據報道可促進食管鱗狀細胞癌的生長和轉移。 CAF 中另一個高度表達的基因 SNAI2 (Slug) 是一種與蝸牛相關的鋅指轉錄因子，可抑制細胞凋亡并促進癌癥進展。 CAF 還表達了幾種常見的生長因子，例如 TGFB1（轉化生長因子β1）、EGF（表皮生長因子）和 VEGFA（血管內皮生長因子 A）。此外，CAFs 中 LSD1（組蛋白賴氨酸去甲基化酶 1）的上調可能會抑制 IFN 激活以逃避免疫攻擊 42。CAFs 產生的 Wnt5a 信號蛋白也可能抑制免疫反應以促進腫瘤轉移。總之，CAFs 可能能夠增強 TME，促進腫瘤的進展。

The presence of CAFs was associated with poorer outcomes of CSCC patients

為了驗證 CAF 的促腫瘤作用，首先使用來自癌癥基因組圖譜 (TCGA)45 的數據集進行生存分析，其中包含 252 名 CSCC 患者。 使用標記基因組（ACTA2、POSTN、ITGB4 和 FAP）計算每位 CSCC 患者的 CAF GSVA 評分。 毫不奇怪，較高的 CAF 信號預測了不利的無進展生存期（HR = 1.66，95%CI = 1.03-2.67，P = 0.038）和總生存期（HR = 1.69，95%CI = 1.00-2.84，P = 0.05） 用于 CSCC 患者。 接下來，測量了 POSTN（一種 CAF 的生物標志物）在 61 個存檔的福爾馬林固定石蠟包埋 (FFPE) CSCC 樣本的癌癥病變附近的基質中的表達水平。 相關性分析表明，POSTN 表達水平越高，分化越差、腫瘤分期越長、淋巴結轉移越頻繁、外周血鱗狀細胞抗原 (SCC) 濃度越高，這進一步證實了 CAF 的促腫瘤發生能力。

總的來說，分析結果表明 CAFs 是 CSCC TME 的重要組成部分，形成屏障以保護癌細胞免受免疫監視和清除，分泌細胞因子以刺激細胞增殖和血管生成，抑制細胞凋亡，并重塑 ECM 以促進腫瘤轉移 . 考慮到 CAFs 的惡化作用，它們可能成為 CSCC 預后和治療的潛在靶點。

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DISCUSSION

盡管疫苗和根治性子宮切除術是預防和治療宮頸癌的有效措施，但復發/轉移宮頸癌的治療仍然是實現消除宮頸癌目標的一大障礙。 在此，我們結合 snRNA-seq 和 ST 技術描繪了 CSCC 的高分辨率轉錄組圖譜，詳細描述了 CSCC 的病因、結構和免疫學特征，這可能有助于 HPV 誘導的宮頸癌的管理和治療。

數據顯示 HPV 在癌性宮頸鱗狀細胞中的轉錄或翻譯活躍，致癌基因（E5、E6 和 E7）高度表達。由于 HPV 具有 DNA 基因組，從轉錄組數據中恢復幾乎完整的病毒基因組是表明晚期腫瘤中病毒活性活躍的生動證據。 HPV 基因組包含兩個多聚腺苷酸化位點。早期多聚腺苷酸化 (AE) 位點位于 E5 和 L2 之間，由 E6、E7、E1、E2、E4 和 E5 的轉錄本共享。晚期多聚腺苷酸化 (AL) 位點位于 L1 開放閱讀框之后，L1、L2 甚至 E7 和 E4 的轉錄本都使用它。由于 Stereo-seq 使用 polyT 捕獲 mRNA，因此與聚腺苷酸化位點相鄰的基因可能有更高的測序機會，這反映在 E5 和 L1 的普遍高于其他基因的表達上。盡管如此，早期基因，尤其是 E5、E6 和 E7，往往比包括 L1 和 L2 在內的晚期基因具有更高的表達。因為 HPV 在分化的鱗狀細胞中組裝和釋放子代病毒粒子，所以在增殖的癌細胞中早期基因的表達高于晚期基因是合理的。此外，雖然與 A E 位點不相鄰，但癌基因 E6 和 E7 在腫瘤中顯示出與 E5 相似甚至更高的表達水平，表明它們在宮頸鱗狀細胞的腫瘤發生中起關鍵作用。事實上，針對病毒 E6 和 E7 基因的治療性疫苗在治療宮頸癌前病變和癌癥方面已顯示出一些有希望的結果。

傳統的bulk RNA 測序和單細胞 RNA 測序通常不足以獲得連續病理狀態的基因表達譜。在此，我們使用包含侵襲前和侵襲性癌癥病變的組織樣本，通過尖端 ST 方法揭示了與發育不良進展相關的關鍵基因和途徑。發現在侵襲前狀態上調的 VDR 途徑對于維持粘膜屏障穩態和預防微生物感染至關重要。 VDR 通路可以被 Toll 樣受體 (TLR) 上調，以誘導抗菌因子，如人體中的導管素。此外，據報道，服用維生素 D 可以改善由結核病感染引起的肺部病變。因此，TLR-VDR 軸可能是對抗 HPV 感染的關鍵。 TLR 家族的激動劑，如咪唑喹啉和瑞喹莫特，以及維生素 D，可能是治療癌前病變和癌病變的可能療法。此外，在我們的測試數據中，侵襲前和侵襲性病變之間的DEG 在區分 CIN 與宮頸癌方面表現出良好的性能。四種上調基因，包括 CD74、MT2A、KRT5 和 KRT15，與幾種類型的鱗狀細胞癌的腫瘤進展相關，它們在 CSCC 中的預后價值可能值得進一步研究。

如今，ICB 療法，尤其是那些使用 PD-L1/PD-1 和 CTLA4 抑制劑的療法，是治療轉移性宮頸癌的新方法之一。幾項研究報告了 PD-L1 在宮頸癌中的廣泛表達，陽性率從 34% 到 96% 不等。然而，單獨的 PD-L1 表達與宮頸癌患者的疾病結果無關 61。事實上，不同試驗對 PD-1/PD-L1 和 CTLA-4 抑制劑的反應率波動很大，而且療效似乎獨立于相關檢查點基因的表達狀態。在我們的研究中，除 LGALS9 和 IDO1 外，CSCC 腫瘤和炎癥區域中大多數免疫檢查點基因的表達水平并不顯著高于非癌樣本中的表達水平。 LGALS9（即半乳糖凝集素 9）通過與 T 細胞表面的 Tim-3 結合或抑制 DC 的抗原呈遞能力來下調效應 T 細胞免疫。雖然已證明半乳糖凝集素 9 信號通路的破壞可誘導患有胰腺導管腺癌的小鼠的腫瘤消退，但在肺轉移小鼠模型中報告了相反的效果。 IDO1 主要在 DC 中表達，有助于將色氨酸降解為犬尿氨酸，從而抑制 T 細胞功能。發現抑制IDO1可以增強HeLa和SiHa腫瘤球細胞的放射敏感性，表明IDO1抑制劑作為放射增敏劑的潛在應用。靶向 LGALS9 和 IDO1 是否可以改善 CSCC 的治療需要進一步探索。我們的研究還揭示了高氧和高營養壓力的腫瘤區域的免疫監視不足，突出了代謝調節在 TME 中的關鍵作用。事實上，最近的臨床試驗將檢查點抑制劑與針對葡萄糖、氨基酸和核苷酸代謝的代謝藥物結合起來。更好地了解免疫反應和新陳代謝之間的串擾將進一步有益于癌癥治療。

CAFs 已在多種類型的癌癥中表征，并且可以分為不同的亞型。雖然細胞系研究表明 CAFs 在宮頸癌細胞增殖中的支持作用，但這是第一項系統描述 CSCC 臨床樣本中促腫瘤 CAFs 的空間分布和生物學特性的研究。由于組織異質性，CAFs 的標記基因因癌癥而異。在本研究中，ACTA2、POSTN、ITGB4 和 FAP 是鑒定 CSCC 中 CAF 的足夠標記基因。其他基因如 KRT4、ITGA1、COL24A1 和 COL7A1 可能作為 CSCC 中 CAF 的互補標記基因，顯示成纖維細胞和癌性鱗狀細胞的細胞特性。這些 CAF 對 TME 的異質性做出了顯著貢獻，TME 通過促進腫瘤生長、轉移和免疫逃避而表現出促腫瘤發生表型。 CAFs⁺腫瘤增殖活躍但缺乏淋巴細胞浸潤。將這些免疫逃避的腫瘤暴露于免疫系統對于根除癌細胞至關重要。因此，建議在治療晚期 CSCC 患者時結合針對 CAF 的療法。研究人員已嘗試使用抗體或抑制劑干擾 CAF 的激活、作用和正?；^程，并正在進行多項臨床試驗。由于 CAF 高度表達的基因對正常組織也是必不可少的，因此需要密切監測其功效和副作用。

總之，數據系統地證明了 CSCC 中病毒基因表達、免疫反應和代謝的高度異質性，表明針對多個生物學過程的聯合藥物或療法將是治療 CSCC 的更好實踐。 除了治療性疫苗和 ICB 療法外，我們的研究結果表明，對 CAF 和腫瘤代謝的干預可以補充目前對 CSCC 的治療。 對這些生物學方面的進一步研究可能有助于開發針對 CSCC 和其他 HPV 誘導的鱗狀細胞癌的新藥物或療法。

Methods

Identification of viral RNA

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Analysis of the progression trajectory of cervical cancerous lesions with ST data

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Multimodal intersection analysis (MIA)

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