研究背景

結合DSP技術解析復雜的腫瘤微環境

在當今生物科技的快速發展下，對于惡性腫瘤的免疫治療已經取得了很大進展，但腫瘤內異質性(ITH)對免疫治療的抑制機理還不清楚。為了進一步探究腫瘤微環境以及腫瘤內異質性（ITH）對于腫瘤生長的影響，研究人員采用DSP（digital spatial profiling）蛋白和CTA檢測方案，結合特定細胞類型的圈選策略對18例接受雙特異性抗體（bsAb）治療的非小細胞肺癌晚期患者（NSCLC）進行樣本分析，并分別獲得了腫瘤區域和基質區域蛋白組和轉錄組表達譜，在空間水平解析了瘤內異質性。通過比較基質區域和腫瘤區域中預測臨床療效的空間標志物分子評分，發現基質區域的分子特征對治療反應有更大的預測能力。

研究方法與樣本選取

圖1 DSP實驗樣本處理流程

（1）樣本：來自18名接受KN046治療的晚期NSCLC患者的20個腫瘤樣本

（2）技術：GeoMx DSP

（3）檢測panel：

● 空間轉錄組檢測：CTA panel，包含腫瘤相關的1800種RNA；

● 空間蛋白組檢測：4個蛋白檢測模塊，包括：Immune Cell Profiling Core，Pan-Tumor Module，Immune Cell Typing Module和IO Drug Target Module，共包括44種靶標蛋白和6種內參蛋白；

（4）感興趣區域（ROI）圈選方案：136個腫瘤 AOI和70個基質AOI通過細胞類型圈選方式進行區域圈選：形態學標記（panCK（上皮細胞），CD45（免疫細胞）, SYTO 13（細胞核））對組織進行染色，識別和區分組織中的腫瘤細胞和基質細胞，獲得其各自表譜；

（5）實驗流程：對目標NSCLC 患者（18- 75歲），每14天靜脈注射 bsAb- KN046，直到疾病進展或達到患者達到忍耐最大限度。并對樣本腫瘤組織進行FFPE切片，DSP蛋白分析和RNA分析。經過樣本制備、ROI圈選、空間蛋白組學和空間轉錄組學等數據分析后，得出了相應結果。

實驗結果分析

（1）DSP識別腫瘤內空間AOI表達模式不同：

為了評估 ITH，研究人員分析了同一樣本基質細胞及腫瘤細胞RNA和蛋白的表達具有明顯差異，分為兩個獨立的聚類。研究人員推測空間上相鄰的腫瘤區域在分子水平上會有更高的相似性，為了證明該推測，研究人員對12個腫瘤樣本進行分析。結果發現，在這12個樣本中，8個樣本中腫瘤AOIs的空間距離與分子聚類模式具有一致性，并且同一ROI中的腫瘤與間質細胞的表達譜比不同區域的表達譜更相似。

圖2 腫瘤內不同AOI的表達形式

（2）腫瘤和間質AOI免疫細胞類型和通路的表征：

實驗人員又進行了淋巴細胞浸潤性評估。腫瘤細胞富集的區域大部分缺乏免疫細胞，因此我們觀察到腫瘤區域中淋巴細胞的豐度明顯低于基質區域(p<0.001)。在基質區域中檢測最多的細胞類型巨噬細胞、CD4 T細胞、成纖維細胞、單核細胞、B細胞和CD8 T細胞。研究人員又對每個樣本的 AOIs 表達程序進行了評估，發現腫瘤區域與癌癥相關的細胞功能復雜程度要顯著高于間質區域。

圖3 腫瘤和間質區域中免疫細胞類型和癌變途徑的表征

（3） DSP標記物的鑒定揭示ITH對篩選生物標志物的影響：

為了評估ITH對篩選與療效相關生物標志物的影響，研究者通過DSP研究bsAb-KN046對腫瘤治療的效果。研究人員將每個腫瘤樣本的所有AOIs蛋白表達數據進行平均，模擬整體測序數據，并與空間segmentation的結果進行比較。共有18個DSP蛋白標記物分別在間質區和腫瘤區被鑒定出來，其中只有4個蛋白（CD45、CD4、34GITR和CD11c）在模擬測序數據中表達，并且這4種蛋白在PR組中的表達增加。為了進一步驗證不同區域內蛋白的表達情況，研究者對PR組和PD組中基質區4種蛋白（CD11c、Tim-3、CD45、CD4）進行mIHC驗證，發現基質區PR組上述4種蛋白的表達均顯著高于PD組。在不同免疫浸潤反應組的患者，也發現四種免疫細胞（CD4 T細胞，樹突狀細胞、巨噬細胞和單核細胞）在PR組中豐度更高。

（4）空間數據顯示基質區域比腫瘤區域具有更大的臨床反應相關性：

考慮到ITH對免疫治療的作用，研究者通過構建療效相關的DSP蛋白標記物的空間signature得分，評估間質和腫瘤區域生物標志物的臨床相關性。結果顯示，PD患者和PR患者在腫瘤區和間質區的signature評分具有顯著差異。為了進一步探究間質和腫瘤特征在對臨床的影響，研究人員采用多因素Cox回歸分析了多種表征對臨床結果的影響。結果顯示，與傳統的腫瘤生物標志物相比，間質signature顯示出更強的臨床相關性。之后研究者通過收集65例接受ICIs治療的NSCLC患者的基質區數據，進一步驗證了空間signature的有效性。這些結果表明，來自基質區域的分子在評估免疫治療的臨床療效方面可能具有更大的潛力。

圖4 構建空間signature預測對免疫治療的臨床反應

研究結論

在bsAb免疫治療的不同治療組中，基質區顯示出更多的差異遺傳信息，基質區構建的標記具有更高的預測效率。

本研究通過使用DSP空間組學技術，對PR和PD不同樣本組患者的不同組織區域進行了ROI圈選，并對ROI中的轉錄組和蛋白組信息進行了分析。結果表示，同一樣本統一區域內的腫瘤和基質區域都表現出明顯的特征，在腫瘤區域和機制區域識別出多個分子對治療反映相關，并篩選出18個相關蛋白可作為預測bsAb的生物標志物。此外通過對腫瘤區域以及基質區域的AUC值（分別為 0.838 和 0.786）進行分析可得知，在臨床治療中基質區域的分子特征對治療反應有更強的預測能力。

參考文獻：

Song X, Xiong A, Wu F, et al. Spatial multi-omics revealed the impact of tumor ecosystem heterogeneity on immunotherapy efficacy in patients with advanced non-small cell lung cancer treated with bispecific antibody. J Immunother Cancer. 2023;11(2):e006234. doi:10.1136/jitc-2022-006234