這一篇繼續學習一些免疫方面的內容，參考文獻在Global analysis of shared T cell specificities in human non-small cell lung cancer enables HLA inference and antigen discovery，2021年3月發表于Immunity，，免疫是一門很深的學問，之前分享了很多了，但是還是盲區太多，看來免疫學作為一門專門的學科大類是有道理的。
Highlights
- The algorithm GLIPH2 enables analysis of shared TCR specificity and HLA prediction
- Tumor-infiltrating T cells cross-react to EBV antigens and shared tumor antigens
- EBV-specific T cells expanded in patients responding to immune checkpoint blockade
- Cross-reactive CD8 T cells express GZMK
Summary
為了識別具有共享抗原特異性的疾病相關 T 細胞受體 (TCR)，使用 GLIPH2（grouping of lymphocyte interactions with paratope hotspots 2）算法分析了來自 178 名非小細胞肺癌患者的 778,938 個 TCRβ 鏈序列。分析確定了超過 66,000 個共享特異性組，其中 435 個與鄰近肺相比，在腫瘤中克隆擴增并富集。使用酵母肽-HLA A*02:01 展示文庫鑒定了這樣一個富含腫瘤的特異性組的抗原表位。這些包括來自上皮蛋白 TMEM161A 的肽，它在腫瘤中過度表達，以及來自 Epstein-Barr 病毒和大腸桿菌的交叉反應表位。研究結果表明，這種交叉反應可能是腫瘤浸潤物中病毒特異性 T 細胞存在的基礎，并且病原體交叉反應可能是多種癌癥的特征。在這項工作中產生的方法和分析管道，以及這里定義的特異性組，為了解癌癥中的 T 細胞反應提供了資源。
Introduction
盡管廣泛使用免疫療法治療癌癥，但我們對這種疾病中 T 細胞特異性的了解非常有限。 抗原特異性是 T 細胞功能的關鍵決定因素，但 T 細胞受體 (TCR) 多樣性和人類白細胞抗原 (HLA) 等位基因多態性帶來的挑戰一直是了解腫瘤浸潤性 T 細胞識別的全部抗原的主要障礙。 已經描述了識別突變蛋白（即新抗原）、非突變腫瘤相關抗原 (TAA) 和病毒抗原的腫瘤浸潤 T 細胞。 在沒有已知病毒病因的腫瘤中，先前的報告已經確定了浸潤腫瘤的病毒特異性 T 細胞，包括識別流感 (flu)、愛潑斯坦-巴爾病毒 (EBV) 或巨細胞病毒 (CMV) 的 T 細胞。 在這些腫瘤中，病毒特異性腫瘤浸潤性 T 細胞被認為不識別腫瘤抗原，通常被稱為“bystander cells”。
在尋找 TAA 方面，新一代測序已經能夠對腫瘤浸潤性 T 細胞中的大量 TCR 可變區進行快速測序，但在利用生成的數據方面仍然存在挑戰。 這部分是由于成百上千個不同的 TCR 序列可以識別相同的肽-主要組織相容性復合體 (MHC) 配體。 為了將這種巨大的序列多樣性減少到更少的特異性，作者開發了一種算法 GLIPH（通過互補位熱點對淋巴細胞相互作用進行分組）和改進版本 (GLIPH2)，它將大量 TCR 序列解析為共享的特異性組 極有可能識別相同的肽-MHC 配體。 這些共享的特異性組是基于相同的氨基酸序列motif或 TCRβ 鏈的互補決定區 3 (CDR3) 內的強同源性建立的。 （這個是目前TCR研究的主要方向）。
在這里，使用 GLIPH2 從 178 名可手術切除腫瘤的非小細胞肺癌 (NSCLC) 患者中發現的 778,938 個 CDR3β 序列中識別出超過 66,000 個高質量的共享特異性組。與相鄰肺組織相比，435 個共享特異性組在腫瘤中被克隆擴增。其中，包含“S%DGMNTE”序列motif的 CDR3β 序列優先用于使用 HLA-A*02 酵母展示文庫進行抗原發現，其中“%”表示不同的氨基酸。具有“S%DGMNTE CDR3β”motif的 T 細胞對非突變腫瘤抗原 TMEM161A 以及來自 EBV 和大腸桿菌的抗原有反應，表明 T 細胞與 TAA 和常見病原體具有交叉反應性。此外，我們發現了內源性抗原和 EBV 表位之間交叉反應的第二個例子，以及另外兩個例子，其中 EBV 特異性 CDR3β 序列在對抗 PD-1 治療有臨床顯著反應的患者中進行了克隆擴增。這表明病原體交叉反應性可能是瘤形成和 T 細胞免疫相互作用的一個重要特征。總體而言，此處介紹的方法能夠對人類癌癥中共有的 T 細胞特異性進行綜合分析，并使用酵母展示庫識別特定抗原，并更廣泛地應用于其他癌癥類型。
Results
Defining shared specificity groups for tumor-infiltrating T cells in human lung cancer
如前所述，GLIPH2 基于局部motif和/或全局同源性識別極有可能具有共享肽-MHC 特異性的 CDR3β 序列。 為了識別識別肺癌中共享腫瘤抗原的 T 細胞，將 GLIPH2 應用于最近發表的 MD Anderson 癌癥中心 (MDACC) 數據集，該數據集包含來自 NSCLC 腫瘤和鄰近肺部的 778,938 個不同的 CDR3β 序列。 該臨床隊列代表 178 名患有可手術切除的疾病且具有可用 HLA 數據的患者。 我們首先用一組特定的過濾標準定義了共享特異性組，并確定了 66,094 個共享特異性組。 為了關注與疾病最相關的 TCR，我們進一步確定了 4,226 個具有克隆擴增證據的特異性組，其中 435 個與相鄰肺相比富含腫瘤。 因此，推斷這 435 個富含腫瘤的特異性組的 CDR3β 成員識別尚未發現的 TAA。
接下來，推斷識別共享腫瘤抗原的 T 細胞會在 NSCLC 患者中進行克隆擴增，但不會在沒有癌癥的個體中進行。 分析觀察到，與其余擴增較少的 TCR 相比，屬于 435 個富含腫瘤的特異性組的 MDACC NSCLC 隊列中擴增的 CDR3β 克隆的百分比顯著更高。 在來自代表 68 名 NSCLC 患者的 202 個腫瘤樣本的 1,173,806 個 CDR3β 序列的驗證隊列中進行了類似的觀察。 相比之下，癌癥患者的相鄰肺（未受腫瘤累及）、健康供體的肺或慢性阻塞性肺病（COPD）患者的肺（無癌癥診斷）具有較少的屬于富含腫瘤的特異性組的 CDR3β 克隆。 總之，這些數據表明 GLIPH2 成功地將大量 CDR3β 序列數據集解析為數百個與 NSCLC 疾病相關的富含腫瘤的特異性組。
Viral specificity group inferences from HLA tetramer datasets
為了驗證由 GLIPH2 建立的共享特異性組，將來自公開可用 HLA 四聚體數據庫的 CDR3β 序列與 MDACC CDR3β 序列結合起來進行聯合 GLIPH2 分析。公開可用的四聚體 CDR3β 序列主要涵蓋病毒特異性，并在實驗中顯示在其各自 HLA 的背景下結合表位。這使我們能夠用 CDR3β 序列在其 HLA 的背景下與獨特的表位相連來注釋一些特異性組，從而推斷其余 CDR3β 成員的共享特異性。聯合分析注釋了 66,094 個共享特異性組中的 394 個。在這些特異性組中，71 個被克隆擴增并用 10 個不同的四聚體進行了注釋。我們發現，與鄰近肺相比，對流感、EBV 或 CMV 衍生抗原具有推斷特異性的 CDR3β 序列在腫瘤中總體上沒有表現出偏差。此外，這些病毒特異性 CDR3β 克隆的估計頻率遠高于初始水平（每 105-106 個），并且與先前報告的通過 HLA 四聚體染色測量的范圍相當。 27 個擴展的流感 M1 注釋特異性組中的 13 個攜帶“RS”或“GxY”motif，已知這些motif對于與流感-M158-66 肽/HLA-A*02 的結合至關重要。網絡分析將這些具有相同 CDR3β 序列成員的四聚體注釋的特異性組組織成社區。屬于給定社區的特異性組始終用相同的 HLA 四聚體注釋，表明某些抗原特異性組雖然共享不同的序列motif，但表現出相同的特異性和 HLA 限制。在用四聚體注釋的 394 個共享特異性組中，634 個相同的 CDR3β 序列成員中有 588 個（93%）連接了用相同四聚體注釋的特異性組。在用四聚體注釋的 71 個克隆擴展的特異性組中，92 個相同的 CDR3β 序列成員中的 92 個（100%）連接了用相同四聚體注釋的組。該結果表明，雖然 CDR3β 序列不是特異性的唯一決定因素，但在絕大多數情況下，對 CDR3β 序列的 GLIPH2 分析會導致正確的特異性推斷。
HLA allele enrichment within TCR specificity groups makes robust inferences of HLA restriction
我們接下來檢查了特異性組內的 HLA 等位基因富集是否準確反映了四聚體注釋的 HLA context。分析量化了所有用四聚體 CDR3β 序列注釋的克隆擴展特異性組中 HLA 超型的富集。這里專注于 HLA-A*02 和 HLA-B*08 超類型，因為這些四聚體定義的 HLA context在 MDACC 數據集中最為豐富。分析推斷，如果給定的特異性組由 HLA/肽四聚體注釋，則 GLIPH2 觀察到屬于同一超型的 HLA 等位基因富集的可能性應該更高。事實上，所有 HLA-A*02 四聚體注釋的特異性組中有 36.7% 富含 HLA-A*02 超型等位基因，而用非 A*02 四聚體注釋的組中沒有一個被富集。雖然 62.5% 的 HLA-B?08 四聚體注釋的特異性組富含 HLA-B?08 超型等位基因，但只有 3.13% 的非 B?08 四聚體注釋的組被富集。因此，特定組內給定 HLA 等位基因的富集準確反映了同源抗原的 HLA 背景。先前的工作還通過在報告基因 T 細胞中表達 TCR 異二聚體并鑒定其肽-MHC 特異性來驗證推斷的 HLA restricting element。
Inferred T cell specificities enable robust comparisons of T cell repertoires across patients
使用 GLIPH2 建立 TCR 特異性組的主要優勢之一是它極大地促進了跨個體的 TCR 庫分析。 在 MDACC 肺癌數據集中，平均約 0.4% 的曲目在任何兩名患者之間共享。 在考慮 4,226 個共享特異性組（富含克隆擴增的 TCR 序列）時，測量此類共享特異性的可能性增加到 1.9%，在考慮所有 66,094 個共享特異性組時增加到 5.3%。 這表明 GLIPH2 捕獲了 T 細胞庫中的共享特異性，其程度是僅通過比較個體之間的 CDR3β 序列是不可能的。
接下來，推斷如果在特定疾病背景下存在有限數量的共享 TCR 特異性，那么在給定足夠多的患者的情況下，特異性組的數量應該達到飽和。通過從攜帶至少一個最流行的 HLA-A02:01 等位基因副本的患者中進行引導，我們發現富含 HLA-A02:01 的特異性組的數量在約 70 名患者時達到飽和。需要來自至少九名患者的Repertoires來建立所有特異性組的一半（n = 77）。相比之下，來自 A?02:01 陰性患者的并發引導占 A?02:01 豐富的特異性組的比例要少得多。此外，來自具有可比 CDR3β 測序深度的獨立健康隊列的引導在相似的樣本量下并未達到飽和，這與攜帶 A*02:01 等位基因的 NSCLC 患者中屬于這些特異性組的 TCR 的患病率較高一致。值得注意的是，建立一半特異性組所需的患者數量取決于克隆擴增的水平、特異性組的數量和測序深度。因此，可以用有限的患者數量建立一套完整的 TCR 特異性組。此外，這些結果表明 HLA 等位基因富集增強了 T 細胞特異性推斷。
Experimental validation of GLIPH2-inferred specificities
鑒于 T 細胞特異性的實驗驗證需要 TCRα/β 對，因此對斯坦福大學治療的 15 名早期 NSCLC 患者進行了單細胞 TCR 測序（scTCR-seq）。從手術切除的標本中制備腫瘤浸潤性 T 細胞，并在測序前通過熒光激活細胞分選 (FACS) 對索引進行分選。 scTCR-seq 產生了 4,704 個配對的 CDR3α 和 CDR3β 序列。將這些 CDR3β 序列與 MDACC NSCLC 序列結合起來進行 GLIPH2 聯合分析。選擇驗證屬于三個流感 M1 注釋特異性組（SV%SNQP、SIRS%YE 和 S%RSTDT）和一個 EBV BMLF1 注釋特異性組 (RTG%GNT) 的四個 T 細胞克隆。我們使用同時缺乏 TCR? 和 TCRβ 的 Jurkat 76 細胞來表達四種 TCR 候選物，并將它們與用各自肽脈沖的 HLA-A*02+ T2 細胞共培養。他們中的三個在 HLA-A*02 的背景下對他們預測的抗原做出了反應，顯示了 GLIPH2 在推斷 T 細胞特異性方面的穩健性。對結核分枝桿菌研究中特異性組成員的類似分析發現，約 80%–90% 的 TCR 識別預測的肽-MHC 配體。
Characterization of tumor-enriched specificity groups
為了確定與疾病相關的特異性組，我們重點研究了 435 個富含腫瘤的特異性組，這些組與相鄰肺相比，顯示出腫瘤中的強烈克隆偏倚。使用來自 84 名患者（總共 n = 178）的轉錄組數據，我們發現屬于這些富含腫瘤的特異性組的 T 細胞的百分比與癌癥進展的基因集富集分析 (GSEA) 標志性特征相關，包括 MYC 和細胞周期程序。相比之下，使用在相鄰肺中擴展的特異性組（n = 114），我們未能觀察到與 GSEA 標志基因集的任何顯著相關性。因此，該結果顯示了 435 個富含腫瘤的特異性組與侵襲性、高度增殖性癌癥表型之間的相關性。接下來，我們系統地檢查了 MDACC 隊列中 435 個富含腫瘤的特異性組中所有 HLA 等位基因的富集情況，并且在大多數情況下僅發現了一個主要等位基因。值得注意的是，我們發現在motif富含多個主要等位基因的情況下，例如，同時富含 HLA-B*07:02 和 HLA-C*07:02 的那些，相關 HLA 等位基因中的強連鎖不平衡可能被觀察。
Identification of a shared specificity group cross-reactive to tumor and pathogen-derived antigens in human lung cancer
在 435 個富含腫瘤的特異性組中，我們優先考慮滿足以下標準的那些：（1）具有來自斯坦福隊列的配對 TCRα/β 克隆型和（2）通過 Fisher 精確檢驗顯著富含 HLA-A*02 等位基因。 這使我們專注于具有“S%DGMNTE”CDR3β motif的特異性組。 因此，選擇帶有 CDR3α 序列 CAVLMDSNYQLIW 和 CDR3β 序列 CASSGDGMNTEAFF 的候選 TCRα/β 克隆型（稱為 TCR2）用于抗原鑒定.
為了鑒定候選克隆 TCR2 的同源表位，我們在野生型 HLA-A*02:01 的背景下篩選了展示四種不同長度（8-11 個氨基酸）肽的酵母文庫。使用 TCR2 多聚體進行的四輪選擇導致 11 聚體文庫中肽序列（模擬表位）的富集（表 S5）。我們對前 20 個富集的擬表位進行了體外刺激試驗，結果顯示前兩個序列“AMGGLLTQLAM”和“KLGGLTMVGV”刺激了表達 TCR2 的 Jurkat 細胞（Jurkat-TCR2）。蛋白質數據庫搜索 (UniParc) 導致鑒定出多個內源性 9 聚體，這些 9 聚體與前兩個擬表位具有密切的序列相似性，并預測結合 HLA-A*02:01，錨定點間隔為 6 個而不是 8 個氨基酸.事實上，頂級模擬表位的 9 聚體變體將 Jurkat-TCR2 細胞刺激到與 11 聚體對應物相當的水平。該結果表明鑒定的 HLA-A*02 抗原實際上是 9 聚體。
在功能上驗證了所有候選內源性肽 9 聚體，類似于前兩個模擬位（11 聚體）。 我們發現來自哺乳動物蛋白 TMEM161A (TMEM9-mer, ALGGLLTPL) 的 9-mers、來自 EBV 的潛伏膜蛋白 2a (LMP9-mer, CLGGLLTMV) 和來自大腸桿菌的腸桿菌素輸出蛋白 (EntS9-mer, LLGGLLTMV) 可以 都刺激 Jurkat-TCR2 細胞。 這些結果表明 TCR2 與來自人類和病原體的抗原發生交叉反應。 HLA 限制的準確 GLIPH2 推斷促進了 HLA-A*02:01 酵母文庫的抗原發現。
為了表明全長蛋白質 TMEM161A、LMP2 和 EntS 可以被處理，呈現在 HLA-A*02:01 上，并激活特定的 T 細胞，在 HLA-A*02+ 293T 細胞中過表達這些蛋白質并測量了 表達 TCR2 的共培養原代 T 細胞的反應。 與脈沖肽類似，表達全長 TMEM161A、LMP2 和 EntS 的 293T 細胞都刺激了共培養的 TCR2-T 細胞，其中 TMEM161A 似乎是最弱的刺激物。 我們進一步進行了生物層干涉測量，以量化每個交叉反應表位對 TCR2 的結合親和力，并表明最弱的刺激物 TMEM9-mer 顯示與 TCR2 的最穩定結合。 因此，該結果表明結合親和力和信號強度的部分解耦，類似于之前的報告。 總之，我們確定了一個富含腫瘤的 TCR 特異性組，對 TAA 和病原體衍生的抗原具有交叉反應性。
TMEM161A is overexpressed on human lung cancer
發現與鄰近肺組織相比，人肺癌中 TMEM161A 蛋白的表達水平顯著更高。我們還注意到一些腫瘤切片上 TMEM161A 表達的一些異質性。我們還檢查了癌癥基因組圖譜 (TCGA) NSCLC 數據集中的 TMEM161A 基因表達。與蛋白質表達一致，我們發現與相鄰肺相比，腫瘤中 TMEM161A 轉錄物的水平更高。與腺癌相比，肺鱗狀細胞癌 (SCC) 中 TMEM161A 的表達水平更高。斯坦福大學隊列樣本的全外顯子組測序未發現 TMEM161A 基因座編碼區內的任何突變，支持其作為非突變 TAA 的作用。同樣，在泛肺癌 TCGA 數據集中發現 TMEM161A 基因座中不到 1% 的有害突變 (n = 6/1053)。此外，肺癌中 TMEM161A 的表達與與細胞增殖程序和原癌基因 MYC 靶標相關的 GSEA 特征相關，這與 435 個富含腫瘤的特異性組揭示的總體趨勢一致。相比之下，TMEM161A 表達似乎與炎癥反應相關的基因組呈負相關。這些數據表明，TMEM161A 是一種在人類 NSCLC 中過度表達的 TAA，并與基因表達特征（如 MYC 和細胞周期）相關。
T cells recognizing TMEM161A antigen have the “S%DGMNTE” sequence motif
我們進一步query了體內 TMEM161A 特異性 CD8+ T 細胞的 TCR 序列身份并檢查了它們的臨床相關性。可以在 MDACC NSCLC 隊列中的 31/78 (40%) HLA-A*02+ 患者中檢測到 TMEM161A 特異性 T 細胞。我們使用 TMEM9-mer/HLA-A*02 四聚體從患者 A6 的腫瘤中分選 T 細胞，其中 TCR2 克隆首次被鑒定。來自腫瘤和鄰近肺的 TMEM9-mer/A02 四聚體 + T 細胞的 scTCR-seq 證實它們攜帶“S%DGMNTE”motif，這與它們在體內對 TMEM161A 的識別一致。我們接下來研究了腫瘤特征如何影響 HLA-A02+ 患者中具有“S%DGMNTE”motif的 T 細胞的募集。我們觀察到，與腺癌相比，在 SCC 中更頻繁地觀察到具有“S%DGMNTE”motif的 T 細胞，類似于 TMEM161A 的表達模式。我們還注意到，突變計數小于 500 的腫瘤中具有“S%DGMNTE”motif的 T 細胞百分比高于突變計數大于 500 的腫瘤（總 n = 34），盡管這一觀察結果可能受總浸潤性 T 細胞數量和突變負荷之間的關聯的影響。最后，雖然在腫瘤中檢測到的帶有“S%DGMNTE”motif的 T 細胞并不能預測患者的預后，但我們觀察到帶有“S%DGMNTE”CDR3β motif的 T 細胞屬于 146 個在沒有復發。
CD8+ T cells with the “S%DGMNTE” motif were also detected in healthy donors
為了表征交叉反應性 TMEM161A 特異性和病原體特異性克隆型，我們使用 TMEM9-mer/HLA-A*02 四聚體或 EntS9-mer/HLA-A*02 四聚體從 HLA-外周血中分選 CD8+ T 細胞。 A?02+ 健康供者和 FACS 的 NSCLC 患者。 我們發現健康供體和肺癌患者中 HLA-A*02/TMEM9-mer+ CD8 T 細胞的頻率沒有差異，這表明這些 T 細胞可能由于與病原體衍生抗原的交叉反應而得以維持。 與此一致，由四聚體或 GLIPH2 量化的這些特定 T 細胞的頻率約為每 103–105 個 T 細胞中的一個（四聚體測量：0.0032%–0.0980%；GLIPH2 推斷：0%–0.2643%） ，高于人 CD8+ T 細胞的初始水平。
無論使用哪種四聚體來分選外周血 T 細胞，分選細胞的 CDR3β 序列始終帶有“S%DGMNTE”motif。 事實上，我們發現了多種 CDR3β 序列共享“S%DGMNTE”motif，其中 % 可能是甘氨酸、谷氨酸或絲氨酸，證實了使用 MDACC 數據在 GLIPH2 分析中看到的多樣性。 此外，單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 數據表明 HLA-A*02/TMEM9-mer+ 細胞主要表現出效應 T 細胞狀態，表明它們以前曾遇到過它們的同源抗原，即使在健康個體中也是如此。
為了在功能上驗證來自四聚體分選克隆的 CDR3α/β 序列，我們生成了穩定的 Jurkat 細胞，表達了用四聚體鑒定的 TCRα/β 鏈。然后，我們在 HLA-A*02:01 的背景下量化了它們對 TMEM9-mer 和病原體衍生的 9-mers 的反應性。我們發現具有“S%DGMNTE”CDR3β motif的 Jurkat 細胞克隆只有在與允許的 TCR2α 鏈（CDR3α：CAVLMDSNYQLIW）配對時才能對所有交叉反應肽產生反應。例如，我們鑒定了一個 CDR3α/β 對，它不攜帶“S%DGMNTE”motif并識別 TMEM9-mer 但不識別微生物抗原 (TCR16)。最后，我們通過將 HLA-A*02+ 肺癌細胞系 H1395 與表達 TCR2 的原代 T 細胞共培養，量化了由交叉反應表位誘導的細胞介導的細胞毒性。與無肽對照相比，LMP9-mer 和 TMEM9-mer 均誘導了超過 50% 的靶細胞裂解。與使用 LMP9-mer 的癌細胞相比，用 TMEM9-mer 脈沖的癌細胞是細胞介導的細胞毒性較弱的靶標，這與 T 細胞活化研究的結果一致。總之，具有“S%DGMNTE”motif的 CD8+ T 細胞與 TMEM161A 腫瘤抗原和病原體衍生抗原 EntS 和 LMP2 與允許的 α 鏈配對時發生交叉反應。識別 HLA-A*02 上的這些交叉反應抗原導致帶有“S%DGMNTE”motif的 CD8+ T 細胞裂解靶細胞。
Phenotypic characterization of TMEM161A-specific CD8+ T cells in lung cancer
我們使用 SMART-seq 方法對來自 10 名 NSCLC 患者的 2,950 個分選的腫瘤浸潤 T 細胞的完整單細胞轉錄組進行了測序，并獲得了它們的配對 CDR3α/β 庫。分析確定了 14 種主要細胞狀態，其中 13 種可以映射到單獨隊列中報告的那些狀態。cluster c5、c6、c12（具有效應表型的 CD8+ T 細胞）、c7 和 c10（具有常駐記憶表型的 CD8+ T 細胞）是擴展最多的。為了揭示特定于共享抗原的克隆的細胞狀態，檢查了 TCR 特異性組成員的 scRNA-seq 譜。我們發現 2.9% 的 T 細胞 (n = 86/2950) 屬于克隆擴增的特異性組。這些 T 細胞中有 12 個是 435 個富含腫瘤的特異性組的成員，而這些 T 細胞中有 13 個被推斷為對病毒表位具有特異性。有趣的是，屬于富含腫瘤的特異性組的 T 細胞偏向于效應表型 (c5)，并且差異表達的 EOMES、KLRG1、GZMK 和其他基因在活化的自然殺傷細胞中表達。一致地，來自腫瘤的 HLA-A*02/TMEM9-mer 四聚體分選的 CD8+ T 細胞也優先表現出效應 T 細胞表型 c5。偽時間軌跡和激活/耗竭特征評分表明這些 T 細胞采用不同的細胞狀態。相比之下，推斷為病毒特異性的 T 細胞表現出的細胞狀態包括效應子 (c5、c6、c12) 和組織駐留記憶表型 (c7)。總之，TMEM161A 特異性 CD8+ T 細胞在 NSCLC 中顯示出一系列效應 T 細胞狀態，與原位識別其同源抗原一致。
Expansion of EBV-specific T cell clones in patients responding to immune checkpoint blockade
為了了解病原體特異性 T 細胞是否可能影響對抗 PD1 檢查點免疫療法的臨床反應，我們分析了兩名對治療有臨床反應的 NSCLC 患者的 TCR 庫。我們對治療前和治療后的血液樣本中的配對 CDR3α/β 庫進行了測序，并鑒定了 102 個在治療后樣本中擴增的 CDR3β 克隆型。在這些擴增的克隆中，41 個屬于在腫瘤浸潤性 T 細胞 CDR3β 庫中鑒定的 99 個特異性組（總 n = 66,094）。我們使用四聚體定義的 T 細胞 CDR3β 序列來注釋這些特異性組，發現 11 個（總共 n = 99）包含 3 個推斷識別 EBV 和流感抗原的擴展 CDR3β 克隆。為了驗證特異性推斷，我們創建了兩個表達 TCRα/β 鏈的 Jurkat 細胞克隆，推斷可以識別 EBV 抗原，以及一個表達野生型 B35 的 T2 細胞系。事實上，在與 T2-B35 細胞共培養后，Jurkat-TCR27 和 -TCR28 細胞都對預測的 EBV 肽有反應。值得注意的是，這些 EBV 特異性特異性組不僅在治療后得到了擴展，而且與相鄰肺相比，還顯示出腫瘤的偏倚，表明對未知 TAA 的潛在交叉反應。此外，我們發現從患者 A11 鑒定的 EBV 特異性克隆 TCR15（CDR3β：CSARGVGNTIYF）被推斷具有與先前報道的在臨床反應時接受免疫檢查點阻斷的患者中檢測到的兩個克隆相同的抗原特異性（CDR3β：CSARVGVGNTIYF和 CSARSGVGNTIYF)。我們的分析表明，這些克隆屬于預測在 HLA-A*02 背景下識別 EBV-BMLF1 (GLCTLVAML) 的“R%GVGNT”特異性組。我們進一步測試了來自人類 ORFeome 的三個相似表位，這些表位被預測為結合 HLA-A*02，發現來自人類 CLDN2 基因座的內源性“LLGTLVAML”也刺激了 Jurkat-TCR15 克隆，表明 TCR15 確實與兩者交叉反應EBV 和 TAA。總之，這些結果表明，患者體內的病原體特異性 T 細胞可能在免疫檢查點抑制劑治療后的抗腫瘤免疫反應中發揮作用。
Discussion
雖然最近關于癌癥中 T 細胞特異性的工作集中在個體通常獨有的新抗原上，但先前的工作也描述了在腫瘤中不適當表達或過度表達的共享腫瘤抗原。在這里，我們開發了一種方法來系統地調查大量 NSCLC 患者的 TCR 庫，以發現共享的 T 細胞特異性。使用 GLIPH2 算法，我們首先將原始 TCR 序列數據提煉成一個更小、更有用的共享特異性組集合，并推斷出 HLA 限制。然后，我們將與疾病相關的 TCR 候選者優先考慮用于抗原發現。酵母文庫的巨大多樣性極大地促進了抗原鑒定和交叉反應抗原的發現。與在哺乳動物細胞中構建的其他 MHC/肽庫不同，酵母庫包含近 109 個隨機排列的肽序列。雖然以前 HLA 限制的不確定性限制了使用酵母文庫進行抗原識別的成功，但我們通過使用 GLIPH2 來推斷候選 TCR 的正確 HLA context克服了這一限制。
在肺癌中使用這種方法，我們發現了 TCR 與腫瘤和微生物抗原交叉反應的例子。因此，這似乎是對病原體特異性 T 細胞浸潤腫瘤的報道的可能解釋。我們之前提出，維持廣泛的 T 細胞庫以抵御病原體可能在很大程度上依賴于 TCR 交叉反應性。已在健康個體的外周血中檢測到自身抗原特異性 T 細胞，在胸腺中修剪但未克隆性刪除，可能避免病原體的免疫“盲點”。由于癌細胞過度表達自身抗原，T 細胞對自身抗原的特異性可能部分解釋了為什么之前的研究觀察到腫瘤浸潤性 T 細胞對自體腫瘤的低反應性。在這項研究中，我們觀察到，與來自 EBV 和大腸桿菌的抗原相比，TMEM161A 特異性 T 細胞對自身抗原 TMEM161A 的反應相對較弱。盡管反應性很弱，但此處提供的數據表明，TCR2 與 TMEM9-mer/A*02:01 配體的結合親和力高于 LMP2 和 EntS。這表明在腫瘤中，TCR 結合與 T 細胞活化的解偶聯可能是另一種機制，通過該機制，在腫瘤進展過程中抑制了針對 TAA 的特定反應的自然過程。這為為什么這些 T 細胞定位于 TMEM161A 過度表達但 EBV 和大腸桿菌可能不存在的腫瘤提供了可能的解釋。對此，之前的報道表明，EBV在肺癌中很少檢出，肺痰中也很少檢出大腸桿菌。
以前，在腫瘤中發現的常見病原體特異性 T 細胞被認為是“bystanders”，而不是 TAA 特異性的。我們的數據顯示 T 細胞對 TAA 的特異性和病原體來源的抗原并不相互排斥。此外，腫瘤中的這些病原體特異性 T 細胞表現出效應表型，而不是疲憊或壓力狀態，并且缺乏 CD39 表達。在這項研究中，我們描述了交叉反應性 T 細胞的例子，與交叉反應性微生物抗原相比，它們對共享的非突變腫瘤抗原的反應性較弱。盡管反應性較弱，但我們的數據表明，交叉反應性 T 細胞可能在抗 PD1 檢查點阻斷的情況下在控制癌癥進展方面發揮作用。盡管尚不清楚這些交叉反應性 T 細胞在免疫檢查點阻斷所釋放的抗腫瘤免疫反應中起什么作用，但人們很容易推測，接觸交叉反應性微生物抗原可能會克服對非突變腫瘤或自身的耐受性-抗原。病原體可以作為免疫療法基礎的想法最初是從威廉·科利的工作中提出的，他在 19 世紀后期開創了一種名為 Coley 毒素的混合細菌疫苗，用于治療癌癥患者并取得了一些成功。最近，腸道微生物組已被證明是癌癥免疫治療反應的關鍵決定因素。在胰腺癌中，在術后存活時間最長的患者中觀察到了一種獨特的微生物組組成。識別腫瘤抗原和微生物抗原的交叉反應性 T 細胞也已被證明可以控制小鼠模型中的腫瘤生長。此外，最近顯示 EBV 和流感可誘導針對共享 TAA 的抗腫瘤免疫。需要更多的研究來了解微生物/TAA 交叉反應性 T 細胞與免疫檢查點阻斷的臨床益處之間是否存在因果關系。
總之，分析提供了一種資源，可以使用可應用于任何腫瘤類型的方法來全面表征來自大型 NSCLC 患者隊列的 TCR。因此，我們將 178 名患者的近 800,000 個 TCR 序列減少到由三個或更多個體共享的超過 66,000 個特異性。在我們確定的 66,000 個特異性組中，然后我們將它們細分為 435 個在腫瘤與相鄰肺中富集的特異性。這個數字可能代表的抗原數量要少得多，因為給定的肽-MHC 配體可以引發五個或更多不同的特異性組。我們發現了非突變的腫瘤抗原和病原體之間有趣的交叉反應性，這可以解釋最近描述名義上病毒特異性 T 細胞浸潤腫瘤的令人費解的結果，這意味著，正如這里提供的其他數據一樣，這種交叉反應性可能是常見的現象。這增加了對這些致病表位的記憶 T 細胞可能引發針對癌癥的交叉反應的前景。也許在瘤形成的早期階段，碰巧過度表達與來自 EBV 的類似抗原發生交叉反應的自身抗原（突變或非突變）的癌前細胞與這些 T 細胞相互作用，從而形成慢性、低度炎癥的腫瘤微環境.為了支持這一點，我們觀察到交叉反應性 T 細胞表達高水平的顆粒酶 K，這在炎癥性疾病和衰老的背景下已有報道。由于已知炎癥會促進腫瘤形成，因此這可能會促進某些細胞變成惡性的過程。
Method
Classification of TCRs and specificity groups
Annotation of specificity groups
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