作者，Evil Genius
單細胞分析流程
今日的參考文章在Integrative spatial analysis reveals a multi-layered organization of glioblastoma, 2024年4月22號發表于cell。
膠質瘤包含不同狀態的惡性細胞。
結合空間轉錄組學、空間蛋白質組學和計算方法來定義膠質瘤細胞狀態并揭示它們的組織。
大腦腫瘤的微觀結構是無限變化的，然而在它們千變萬化的外觀中，某些相似性結構可以被追蹤到。膠質瘤通常是高度異質性和浸潤性的，但特定的空間模式廣泛地被注意到。
膠質母細胞瘤(GBMs)的復發性空間結構:膠質瘤細胞依賴或模仿大腦原有的正常結構，具有侵襲性的有組織的繼發結構;癌細胞的無定形排列;癌細胞形成的模式不依賴于先前存在的正常結構的適當結構;壞死區域周圍有間充質組織反應。因此，壞死灶(和缺氧)以及正常大腦神經元結構周圍的區域與局部組織有關，而在這些區域之外，膠質瘤組織以缺乏組織學組織為主。
scRNA、CODEX、Visium。
局部腫瘤微環境(TME)是癌細胞狀態的主要決定因素。
1、神經膠質瘤的空間轉錄組學
使用兩種初始方法對spot進行分類和標注。首先，通過平均每個染色體區域的基因表達來進行拷貝數畸變(CNA)推斷，將spot分類為惡性，非惡性或混合spot。其次，采用Leiden聚類方法對每個樣本進行聚類，并在多個切片的情況下對每個腫瘤進行聚類，并通過基因集富集分析對聚類進行注釋。當單樣本Leiden聚類將樣本中相似成分的spot組合在一起時，下一步的目標是更好地捕捉細胞狀態的連續性質。為此，對每個樣本進行了非負矩陣分解(NMF)，并推導出穩定表達program。
Experimental design and spot classification per sample
Segmentation, CNA inference, and per-sample clustering
2、膠質瘤的復發表達異質性
比較了通過Leiden聚類和NMF在單個GBM樣本中鑒定的492個基因表達跑program。
spot的表達譜反映了不同細胞狀態的組合
Deriving and annotating spatial metaprograms
Validation and further analysis of spatial metaprograms
Mapping spatial metaprograms to cell states
3、空間蛋白質組學作為膠質瘤圖譜的補充
雖然Visium覆蓋整個組織，但它的空間分辨率較低，不適合捕獲罕見或空間分散的細胞類型和細胞狀態。因此，使用CODEX作為補充方法，在真正的單細胞蛋白水平上驗證分析結果。40個標記抗體panel是基于單細胞GBM MPs和標準標記設計的，幾乎涵蓋了所有相關的細胞類型和細胞狀態。
對單細胞的蛋白表達譜進行聚類,為了能夠直接比較CODEX和Visium數據，使用STalign對兩個數據集進行空間對齊。在Visium數據中，一些細胞類型和狀態無法通過無監督分析檢測到，因為它們傾向于代表它們所在spot的一小部分。例如T細胞和B細胞很少占主導地位，它們的低mRNA含量進一步限制了它們的信號，因此無法通過無監督分析識別T細胞或B細胞MPs（對于Visium）。
CODEX數據能夠評估每個state的細胞密度。非惡性腦細胞類型的密度(平均5個細胞/spot)低于惡性細胞、免疫細胞和內皮細胞(平均9個細胞/spot)。在惡性狀態中，染色質- REG和MES樣密度最大，NPC樣、OPC樣和AC樣密度最小。
Spatial profiling of gliomas by CODEX
GBM profiling by CODEX
4、GBM腫瘤包含共同發生的結構化和非組織化區域
每個樣本中相鄰spot和分散spot的細胞狀態豐富程度，即“空間相關性”。空間相關性因樣本而異，例如在一些樣本(“結構化”)中，大多數狀態往往具有高相關性，而在其他樣本(“無組織”)中，大多數狀態往往具有低相關性。
根據其局部環境的一致性將每個點分類為屬于結構化，無組織或中間區域。結合(CNA分數)進一步細分結構化和無組織區域，對空間結構進行定義。
Spatial distribution of cell states and organization zones
Association between spatial coherence and MES-Hyp
Spatial coherence and organizational zones
5、癌細胞狀態的空間組織與MES-Hyp（缺氧類的間質細胞）豐度有關
MES-Hyp在Struct-Malig（惡性）區富集。即使從空間相關性計算中去除MES-Hyp spot，富含MES-Hyp的樣品仍具有較高的空間相關性。因此，與缺氧相關的組織增加超出了缺氧癌細胞狀態本身，靠近MES-Hyp spot的所有惡性細胞狀態都比缺乏MES-Hyp spot的相同細胞狀態更有組織。因此，缺氧周圍的結構區明顯比與缺氧相關的兩種組織學注釋——pseudopalisading and necrosis (PAN) and MVP更為多樣。雖然神經元spot在空間上也是高度連貫的，但在含有神經元的區域中沒有觀察到這種擴展結構對相鄰細胞狀態的影響。因此，缺氧可能提供了一種外在的力量，在大的組織區域上賦予了表達狀態的結構連續體，從而形成了一個已知的局部結構，通過組織學可以看到，而一個以前未被發現的遠程結構可以通過細胞狀態的分子譜檢測到。在GBM和IDH突變的膠質瘤中，非缺氧區在很大程度上是disorganized(Disorg-Malig)，這與組織學上看到的膠質瘤的整體disorganization一致。
如果缺氧是空間組織的驅動因素，那么將無序的GBM類器官置于缺氧條件下可能會誘導癌細胞狀態的組織，實驗表明完全的狀態轉變可能需要長期暴露于缺氧和/或壞死、免疫細胞和血管。此外，類器官模型研究包含核心惡性GBM細胞狀態，但它并沒有穩定地再現人類腫瘤樣本的空間組織，即使在含有MES-Hyp的對照類器官中也是如此。
6、Pairwise state-state spatial associations recur across samples and scales
為了量化細胞狀態之間的空間關系，設計了三個互補的度量，突出了不同分辨率水平下的狀態耦合。首先，兩種狀態的區域組成，定義為它們在預定義半徑(用r表示)的六邊形窗口上的豐度之間的相關性。其次，兩種細胞狀態之間的鄰接性，定義為一種狀態在另一種狀態的直接鄰近spot上的富集。第三，同一region內兩個state的共定位。分析觀察到在大范圍的區域中狀態關系的總體一致性，同時在考慮所有measures時也確定了特定的scale-dependent shifts(distance-dependent coupling)(結構化region的measures之間的一致性為67%，無組織region的measures之間的一致性為57%)。
從區域組成上看，結構化和無序區域具有相似數量的顯著空間關聯，且這些關聯在很大程度上是一致的，而共定位和鄰接度量主要識別結構化區域特有的相互作用。因此，即使在沒有由鄰近細胞或spot定義的直接空間格局的情況下，區域組成也趨于保持。接下來就是要分析細胞間的共定位。
Spatial associations between states across scales
Spatial relationship analysis
7、結構化區域GBM空間組織的分層模型
為了檢驗上述細胞間相互作用是否可以組合形成一個高階組織，分析生成了一個網絡圖，其中node代表狀態，edge代表共識相互作用。該圖顯示了一個五層組織，其中dege只存在于同一層內或相鄰層之間。這種組織似乎以缺氧梯度為主，第一層由MES-Hyp (L1:核心缺氧/壞死)組成，其次是第二層由MES-Ast、MES-like和inflammaty - mac (L2:缺氧相關)組成。第三層包括可能有助于解決缺氧的免疫和血管生成相關的細胞類型和狀態，包括Vasc、Mac和增殖- metab (L3:血管生成反應/免疫中樞)。L3后，缺氧可能被解決，使得神經發育惡性狀態的存在可能更加依賴氧氣- AC-like，OPC-like和NPC-like(L4:惡性神經發育狀態)。最后，非惡性腦細胞類型(反應性AST、寡糖和神經元)反映了向浸潤腦實質(L5:腦實質)的轉變。將spot映射到五層保留了結構化和無組織區域之間的區別。CODEX數據在L3(血管生成反應/免疫中樞)中添加B細胞和T細胞后生成了類似的結構。
為了更好地理解我們的層模型，將樣本分配到五個結構，并與神經病理學家的組織病理學注釋和來自組織病理學特征的IVY Gap轉錄特征進行了比較。研究發現模型與經典注釋高度一致，L1類似于PAN, L3類似于MVP, L4類似于細胞腫瘤，L5類似于前沿。值得注意的是，缺氧鄰近層(L2)和局部缺氧的小區域不能通過經典的組織病理學或IVY Gap轉錄程序來區分。同樣，將來自五層的轉錄特征與對應于顯微解剖組織病理學特征的轉錄特征進行比較，除了L2不能直接映射到組織病理學特征外，總體上是一致的。因此，通過對基因表達的無監督分析，在很大程度上趨同于膠質瘤的主要組織學特征，但準確性提高了，并增加了一個新的低氧鄰近狀態層(L2)。此外，可以在細胞狀態的詳細分辨率上重新定義經典的組織病理學特征。
A layered model of GBM spatial organization
GBM state layers
結合Visium與CODEX和計算方法來定義膠質瘤的組織。
具有有限空間聚類的細胞狀態信號被Visium稀釋，可能無法通過無監督分析檢測到，如細胞周期和低豐度細胞類型(如T細胞)的情況。
研究發現了三種空間組織模式。首先，細胞傾向于被處于相同狀態的其他細胞所包圍(特定狀態的cluster)，形成了高度富集的個體狀態的局部環境。這種模式可以從每個spot內相似細胞的聚類以及分配給同一MP的spot的聚類來證明。這種聚類表明空間位置在調節細胞狀態中起著核心作用。
最后更新一個小內容，就是關于單細胞空間突變信息分析導論提到的突變信息，那么如何知道單細胞空間檢測到的時候是熱點突變位點，大家可以參考cancer hotspots,網址在http://www.cancerhotspots.org/#/home。
