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好了，這一篇繼續分享單細胞空間的聯合分析，看一下在腦轉移CD8+ T細胞的時空圖譜，參考文獻在The CD8+ T cell landscape of human brain metastases，看來單細胞空間的聯合分析運用，慢慢就會成為主流。
Abstract
盡管檢查點阻斷免疫療法改善了結果，但腦轉移患者在轉移性癌癥患者中預后最差。免疫檢查點阻斷劑靶向耗盡的 CD8+ T 細胞上的抑制性受體，如 PD-1，以恢復其抗癌功能。然而，許多患者在對免疫檢查點封鎖的初始反應后沒有反應或進展，盡管腦轉移的局部治療有很好的選擇，但遠處顱內衰竭很常見。為了開發更有效的腦轉移治療策略，了解腦轉移浸潤 CD8+ T 細胞的表型是必不可少的。在這里，對腦轉移瘤中包含的 CD8+ T 細胞進行了詳細的表征。腦轉移灶被 CD8+ T 細胞密集浸潤；腫瘤樣本的血液污染很少見。與患者匹配的循環細胞相比，腦轉移浸潤的 CD8+ T 細胞具有獨特的表型，其特征是 PD-1 的表達更頻繁，亞群由額外的共抑制分子和駐留標記 CD69 的表達定義。單細胞 RNA 測序鑒定了腦轉移浸潤 PD-1+ CD8+ T 細胞內的四種表型亞群。其中兩個populations——一個終末分化populations和一個分裂populations——的特征是共抑制分子的高表達和缺乏祖細胞標志物（如 TCF-1）的表達。終末分化和分裂populations之間存在顯著的 T 細胞受體 (TCR) 重疊，表明分裂細胞產生終末分化細胞。這兩個populations與其他腦轉移浸潤性 PD-1+ CD8+ T 細胞之間的 TCR 重疊最小。來自腦轉移浸潤 CD8+ T 細胞的 T 細胞克隆在循環中很少見，特別是來自終末分化和分裂populations的克隆。分析系統地鑒定了對微生物抗原特異的bystander CD8+ T 細胞；這些細胞浸潤腦轉移灶并表達與衰竭的祖 CD8+ T 細胞共享的基因，如 TCF7 和 IL7R。對腦轉移瘤進行了空間轉錄組學，并使用一種新方法從空間轉錄組學數據中獲取 TCR 序列。這些數據揭示了 TME 內由其基因表達模式和細胞因子譜定義的不同生態位。終末分化的 CD8+ T 細胞優先占據腫瘤實質內的niche。總之，結果表明，抗原特異性限制了腦轉移 TME 內 CD8+ T 細胞可用的空間定位、表型狀態和分化途徑。
Introduction
腦轉移會影響大約 20% 的癌癥患者，與顱外轉移相比，腦轉移的總生存期明顯更差。盡管它們對免疫檢查點阻斷 (ICB) 有反應，但腦轉移瘤也接受局部治療 - 放射治療有或沒有手術切除 - 因此很難辨別 ICB 后 CD8+ T 細胞重振對這些腫瘤的孤立影響。大腦包含一個獨特的免疫環境，通常被認為具有免疫抑制作用，可保護中樞神經系統 (CNS) 免受過度炎癥的影響。Although there is loss of blood-brain-barrier (BBB) integrity within brain tumors, the consequent less-selective blood-tumor-barrier (BTB) and surrounding stroma of brain tissue may together affect inflammatory signaling and cell recruitment to the tumor microenvironment (TME) of brain metastases.腦轉移瘤被 CD8+ T 細胞浸潤，這可能與 CD8+ T 細胞浸潤患者匹配的原發腫瘤無克隆相關，這表明與原發腫瘤相比，腦轉移可能具有不同的決定因素來控制對 ICB 的反應。
CD8+ T 細胞是細胞毒性淋巴細胞，通過其 T 細胞受體 (TCR) 與 MHC I 類肽復合物的抗原特異性結合來識別感染或腫瘤細胞。抗原清除后，效應 CD8+ T 細胞分化為記憶細胞，防止抗原再次暴露。在抗原未被清除的情況下，如癌癥或慢性感染，效應 CD8+ T 細胞會耗盡，一種以增殖和細胞毒性能力受損為特征的狀態。耗竭的 CD8+ T 細胞表達抑制性分子，如 PD-1，進一步促進耗竭表型。 PD-1 和其他抑制通路是 ICB 藥物的目標，ICB 藥物會阻斷衰竭的 CD8+ T 細胞中的抑制性信號傳導，以挽救其增殖和細胞毒性功能。 ICB 藥物在癌癥治療中的臨床應用已導致疾病控制和患者存活率的顯著改善，但是很大比例的癌癥患者患有難治性疾病，對 ICB 沒有反應或在初始反應后進展。提高 ICB 功效的一種策略是同時阻斷在耗竭的 CD8+ T 細胞上表達的多種抑制性分子。為了確定這種組合方法的潛在治療靶點，需要對靶點耗盡的 CD8+ T 細胞進行詳細的表型表征。
耗盡的 CD8+ T 細胞由具有不同功能、抑制性分子表達和組織歸巢模式的不同表型亞群組成。austed progenitor PD-1+ CD8+ T 細胞由轉錄因子 TCF-1 的表達維持，具有自我更新和產生進一步分化的子細胞的能力。Transitory PD-1+ CD8+ T 細胞是這些祖細胞的直接后代，其特征是效應分子的表達和 TCF-1 的缺失。這些transitory cells 是遷移的；在這種狀態下發現了癌癥和慢性感染中的循環抗原特異性 CD8+ T 細胞，以 CX3CR1 表達為標志。在遷移到非淋巴組織后，這些transitory cells 進一步分化為終末分化的populations，抑制分子的表達增加。這些most-exhausted CD8+ T 細胞駐留在非淋巴組織中，效應器功能較差，并且缺乏增殖能力。
這些 CD8+ T 細胞群對 PD-1 通路阻斷的反應各不相同。 ICB 后觀察到的增殖爆發需要耗盡的祖細胞群，這會導致暫時效應細胞的數量顯著增加。 ICB 還作用于抗原部位的效應 CD8+ T 細胞，通過增加顆粒酶和穿孔素等分子的表達來改善其效應功能。 鑒于其需要響應 PD-1 通路阻斷的增殖爆發，耗盡的 CD8+ T 細胞的祖細胞群在腫瘤免疫學研究中受到了極大的關注，其中許多已經量化了腫瘤浸潤的 TCF-1+ 細胞。 然而，腫瘤浸潤性 TCF-1+ CD8+ T 細胞的抗原特異性很少被確定。
在人乳頭瘤病毒陽性 (HPV+) 頭頸部鱗狀細胞癌中發現了腫瘤特異性耗盡祖 TCF-1+ CD8+ T 細胞，該細胞生長在口咽淋巴組織中。最近還在黑色素瘤和非小細胞肺癌中發現了類似的祖細胞，其中大多數腫瘤特異性 CD8+ T 處于終末分化狀態。在小鼠模型中，抗原特異性耗盡祖 CD8+ T 細胞在腫瘤引流淋巴結中富集，并且在慢性感染期間僅在次級淋巴器官中發現。然而，尚不清楚腫瘤特異性耗盡的祖 CD8+ T 細胞是否存在于大腦中生長的腫瘤中。在缺乏抗原特異性信息的情況下，通常從表型推斷 CD8+ T 細胞功能。然而，這種方法被一些分子標記在 CD8+ T 細胞分化的多個階段的表達所混淆。例如，TCF-1 由幼稚、記憶和衰竭的祖 CD8+ T 細胞表達。 CMV 和 EBV 特異性效應記憶 CD8+ T 細胞共表達 TCF-1 和 TOX，一種與 T 細胞耗竭相關的轉錄因子，并且在原發性和轉移性腦腫瘤中發現了 EBV 和流感特異性 CD8+ T 細胞。此外，據報道，大腦駐留記憶細胞可維持抗原非依賴性 PD-1 表達。
在這里，對 31 名接受手術切除大的和/或有癥狀的腦轉移瘤的患者的腦轉移浸潤 CD8+ T 細胞及其周圍 TME 進行了詳細的表征。腦轉移灶被 CD8+ T 細胞充分浸潤，其中大部分是 PD-1+。使用單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq)，在浸潤腦轉移的 PD-1+ CD8+ T 細胞中鑒定了四個clusters：分裂細胞、終末分化細胞和兩個與衰竭的祖細胞共享一些表型特征的細胞群。這前兩個cluster彼此共享顯著的克隆重疊，但與祖細胞樣種群具有最小的 T 細胞受體 (TCR) 重疊。我們系統地鑒定了腦轉移浸潤 CD8+ T 細胞中微生物抗原特異性的bystander細胞；這些在終末分化和分裂的群體中很少見，并且具有類似于衰竭祖細胞的表型。bystander在腦轉移浸潤的 PD-1+ CD8+ T 細胞和循環 PD-1+ CD8+ T 細胞中以相似的頻率存在。為了確定腫瘤內特定 CD8+ T 細胞克隆的位置，我們使用一種新方法從空間轉錄組學數據中獲取 TCR 序列，并表明來自每個表型群體的 CD8+ T 細胞在空間上僅限于腦轉移 TME 的特定區域，具有不同的基因表達模式和細胞因子譜。總之，我們的結果表明，腦轉移被不同的 CD8+ T 細胞群體浸潤，這些 CD8+ T 細胞采用特定的表型，并根據抗原特異性分離到 TME 內的不同niche中。這些數據可以指導治療腦轉移瘤的新型免疫治療策略。
Results
Human brain metastases are well-infiltrated by CD8+ T cells
在超過 18 個月的時間里，我們從埃默里大學醫院的 31 名接受了至少一個腦轉移瘤手術切除的患者中收集了新鮮的腦轉移腫瘤標本和匹配的血液樣本。 樣本是在手術切除時新鮮獲得的，包括多種原發腫瘤類型的混合物，其中最豐富的是肺癌，這與它是最有可能轉移到大腦的原發癌癥一致。所有患者都未接受免疫治療。 通過流式細胞術定量所有樣品的免疫浸潤。 一部分樣本用于高參數流式細胞術、單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq)、T 細胞受體 (TCR) 測序和具有空間分辨轉錄組學的免疫組織化學.
腦轉移灶被免疫細胞浸潤，范圍從每克腫瘤 2.9 x 104 到 2 x 107 個 CD45+ 淋巴細胞不等（中位數為 7.6 x 105），其中乳腺癌腦轉移灶的浸潤密度最低。 CD8+ T 細胞浸潤也各不相同（范圍為 3.4 x 103 至 1.5 x 107，中值 2.0 x 105 CD8+ T cells/gram of tumor），乳腺癌組織學再次顯示浸潤密度最低。 盡管樣本之間存在顯著差異，但無論原發腫瘤類型如何，CD8+ T 細胞在腦轉移灶中的淋巴細胞比例相似。
A subset of brain metastasis-infiltrating CD8+ T cells have a progenitor phenotype
為了query腦轉移浸潤 CD8+ T 細胞的表型，對患者匹配的腫瘤浸潤和循環 CD8+ T 細胞進行了高參數流式細胞術。盡管存在一些差異，但表達 PD-1 的腦轉移浸潤 CD8+ T 細胞的頻率在不同的腫瘤組織學中是一致的。我們比較了其他共抑制分子、轉錄因子和效應分子顆粒酶 B (GZMB) 在 PD-1- 和 PD-1+ CD8+ T 細胞上的表達。與 PD-1- 細胞相比，TOX 和共抑制分子 TIM3、CD39 和 CTLA-4 在 PD-1+ 細胞上顯著更高。盡管 CD69 在 PD-1+ 細胞上表達更高，但近一半的 PD-1- 細胞也表達 CD69，表明這些細胞中的一部分也存在于腫瘤中。雖然效應分子 GZMB 和共刺激分子 CD28 在 PD-1+ 和 PD-1- CD8+ T 細胞之間的表達相似，但 CD8+ T 細胞的祖細胞功能標志物（如 CD127 和 TCF-1）在 PD-1- 細胞中更高。
關于腦轉移瘤中 TCF-1+ CD8+ T 細胞的豐度和表型知之甚少，并且不清楚腫瘤特異性耗盡的祖細胞是否存在于這些腫瘤中。 CD127 和 CD28 已被用作慢性感染和癌癥中 TCF-1+ 祖 CD8+ T 細胞的細胞外標志物。在腦轉移浸潤的 CD8+ T 細胞中，與 PD-1+ TCF-1- 細胞相比，CD28 和 CD127 在 PD-1+ TCF-1+ 上的表達頻率更高，但它們的表達并未完全重現 TCF-1 的表達。 CD127 在 PD-1+ TCF-1- 細胞中大部分不存在，但僅在一半的 PD-1+ TCF-1+ 細胞中表達。 CD28 是一種更敏感的 TCF-1 表達標記物，在超過 75% 的 TCF-1+ 細胞上發現，但缺乏特異性，在超過 50% 的 TCF-1- 細胞上表達。轉錄因子 TOX 是 CD8+ T 細胞耗竭的標志物和調節劑，在癌癥和慢性感染的抗原特異性 CD8+ T 細胞上表達。在我們的隊列中，44% 的腦轉移浸潤 TCF-1+ CD8+ T 細胞表達 TOX，37% 是 PD-1+； 14% 的 TCF-1+ CD8+ T 細胞共表達 PD-1 和 TOX。因此，盡管腦轉移灶中 TCF-1+ CD8+ T 細胞的頻率很高，但這些細胞表型多樣，僅 TCF-1 表達可能不足以作為腫瘤特異性 CD8+ T 細胞祖細胞功能的標志物。
Phenotypically distinct populations of CD8+ T cells infiltrate brain metastases
所有腫瘤浸潤和匹配的循環 CD8+ T 細胞的 FlowSOM 聚類確定了六個populations。cluster 1 和cluster 2 優先在血液中發現，cluster 4 和cluster 5 僅是腫瘤浸潤。cluster 3在血液和腫瘤中以高頻率存在，cluster 6在血液和腫瘤中都是罕見的。cluster 1 由初始 CD8+ T 細胞組成，其特征是表達 CCR7 和 CD45RA；它在腫瘤中的低頻率表明腦轉移標本的血液污染最小。cluster 2 中的細胞主要是 CD45RA+ 并表達高水平的顆粒酶 B。cluster 3 存在于循環和腫瘤compartments中，由具有高水平 CD28、CD127 和 TCF-1 的異質 PD-1- 和 PD-1dim 細胞組成。cluster 4 和 5 中的細胞均表達 CD69，這與組織駐留及其在腫瘤中的優勢一致。cluster 4 和 5 中的細胞也表達 CD38，TCF-1 和 CD127 的表達量較低；后兩種標志物在腫瘤內 CD8+ T 細胞上的表達主要限于cluster 3，即腫瘤和循環compartments之間共享的cluster。cluster 5 似乎是一個耗盡的、終末分化的 CD8+ T 細胞群，表達 PD-1 以及其他共抑制分子，包括 CTLA-4、CD39 和 TIM-3。cluster 5 中的大多數細胞也表達 TOX，并且是 TCF-1-。cluster 6 中的細胞正在分裂 (KI-67+) 并表達激活標記，例如 HLA-DR 和 CD38，以及耗竭標記，例如 PD-1。cluster 6 細胞表達 CD28，但 TCF-1 和 CD127 水平低。
Brain metastasis-infiltrating CD8+ T cells comprise four metaclusters with distinct transcriptional phenotypes
對腫瘤相關病毒和新抗原表位特異的 CD8+ T 細胞表達 PD-1。在我們的隊列中，腫瘤內的 PD-1 表達在終末分化的第 5 cluster和分裂細胞中最高。 PD-1 在富含腫瘤的cluster 4 和cluster 3 中的一些細胞中也以較低水平表達，這在血液和腫瘤之間共享。為了確定轉錄譜、詢問分化途徑并檢查這些 PD-1 表達細胞的抗原特異性，在手術切除后立即對從三個非小細胞肺癌 (NSCLC) 腦轉移瘤和兩個黑色素瘤腦轉移瘤中分離的分選 PD-1+ CD8+ T 細胞進行了 scRNA-seq 和 TCR 測序。選擇這兩種組織學是因為它們通常會轉移到大腦。還從患者匹配的血液中分選了幼稚 CD8+ T 細胞作為對照。從 22,828 個已測序的細胞中，我們確定了 14 個 PD-1+ CD8+ T 細胞群，這些細胞群被分層聚類為 5 個具有相似基因表達模式的meta-cluster：A、B、C、Dividing (D) 和 Na?ve。與我們的流式細胞術分析一致，原始細胞主要存在于血液中。五名患者中有四名在每個 AD cluster中都有細胞，除了患者 17，他在meta-cluster C 中沒有細胞。肺癌腦轉移與黑色素瘤的腦轉移之間每個meta-cluster中的細胞百分比沒有差異，這表明在我們的隊列中，起源組織并沒有強烈影響腦轉移浸潤的 PD-1+ CD8+ T 細胞的表型。
metaclusters A 和 D 中腫瘤浸潤的 PD-1+ CD8+ T 細胞具有與 FlowSOM cluster 5 相似的終末分化表型，其特征是編碼共抑制分子的基因高表達，如 CTLA4、ENTPD1（CD39）、HAVCR2 (TIM-3) 和 LAG3，與包含腫瘤反應細胞的這一populations一致。分裂metacluster中的細胞還通過細胞周期基因的高表達來定義，例如 MKI67 (KI-67) 和 TOP2A。基因集富集分析 (GSEA) 顯示，在 CD8+ T 細胞耗竭的鼠 LCMV（淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒）模型中表征的瞬時轉錄特征在 Dividing metacluster 中富集，表明這些細胞可能正在經歷從干細胞樣到終末期的分化-分化的 PD-1+ CD8+ T 細胞。metacluster B 和 C 表達最低水平的共抑制標記。它們通過在metaclsuter C 中組織駐留基因（如 CD69）的更高表達而相互區分。metaclsuter B 和 C 與終末分化和分裂細胞相比包含具有更高表達祖標記 TCF7 (TCF-1) 和IL7R (CD127)。
Terminally-differentiated CD8+ T cells have minimal clonal overlap with circulating or progenitor-like tumor-infiltrating CD8+ T cells
為了確定循環和腦轉移浸潤 CD8+ T 細胞之間的克隆關系，我們對從患者匹配的外周血中分選的非初始 PD-1+ 和 PD-1- CD8+ T 細胞進行了 TCR 測序。 與循環 PD-1-CD8+ T 細胞相比，循環 PD-1+ CD8+ T 細胞的 TCR 多樣性較低，與腫瘤浸潤細胞的重疊更多。 然而，循環和腫瘤浸潤 CD8+ T 細胞之間的總體重疊很小，這表明表達富含腫瘤的 TCR 的循環 CD8+ T 細胞很少見。 循環腫瘤特異性 CD8+ T 細胞似乎更加罕見，因為來自終末分化細胞的 TCR 在血液中很少被發現。 確實表達富含血液的 TCR 的腫瘤浸潤細胞主要位于metaclsuters B 和 C。這與流式細胞術數據一致，其中腫瘤中的 TCF-1 和 CD127 表達僅限于 FlowSOM cluster 3，這個細胞群在血液和腫瘤之間共享。
為了探究腦轉移浸潤 PD-1+CD8+T 細胞的分化途徑，分析了 scRNA-seq metacluster之間的 TCR 重疊。終末分化和分裂細胞（分別為metacluster A 和 D）彼此之間有大量的 TCR 重疊。然而，這些分裂和耗盡的細胞與metaclusters B 和 C 表現出最小的 TCR 重疊，其中包含具有較少耗盡表型的細胞。每個患者腫瘤內的大多數 CD8+ T 細胞克隆——尤其是最豐富的克隆——大多僅限于耗盡（metacluster A/D）或祖細胞樣（metacluster B/C）表型，表明這些群體在很大程度上具有未共享的抗原-特異性。與metacluster B/C 中的細胞相比，終末分化細胞（metacluster A/D）中的 TCR 多樣性也較低。基于這些數據，假設metacluster B 和 C 中的細胞可能主要是對非腫瘤抗原特異的記憶bystander CD8+ T 細胞，并且在從循環遷移后已駐留在腫瘤內。
Brain metastasis-infiltrating bystander CD8+ T cells have phenotypic similarities to exhausted progenitor CD8+ T cells
以前的研究已經確定了腫瘤浸潤的 bystander CD8+ T 細胞，但對腦轉移的 bystander 浸潤知之甚少。 我們查詢了 VDJdb，這是一個具有已知特異性的 TCR 數據庫，與來自我們的 scRNA-seq 數據的 TCR 匹配，并在兩名患者中的每一個中確定了一個 CMV 特異性 TCR。 兩種 CMV 特異性 TCR 均由metacluster B/C 中的細胞專門表達。 為了通過實驗query腦轉移浸潤bystander CD8+ T 細胞的豐度和表型，我們體外擴增了四名患者的 PBMC，這些患者的 scRNA-seq 數據是可用的。 我們用微生物肽池 (CEFX) 刺激這些細胞，通過 FACS 分離 IFNγ+ 和 IFNγ-CD8+ T 細胞，并對每個子集進行 TCR 測序，以確定對 CEFX 刺激有細胞因子分泌反應的 TCR，因此是微生物特異性的。
比較來自該測定的 TCR 序列與從上述 scRNA-seq 數據中鑒定的序列顯示，CEFX 特異性細胞占腦轉移浸潤 PD-1+ CD8+T 細胞的 0.07% 至 1.70%。 從表型上看，在所有四名患者的 B/C metacluster中都發現了 CEFX 特異性腦轉移浸潤性 PD-1+ CD8+ T 細胞，這些細胞顯著富集。 中位數為 1.9% 的metacluster B/C 細胞是 CEFX 特異性的，而metacluster A 和 D 為 0.07%，總循環 PD-1+ CD8+ T 細胞為 1.1%。 值得注意的是，來自患者 17 的 12.3% 的metacluster B/C 細胞是 CEFX 特異性的。 重要的是，這些經過實驗驗證的bystander細胞中的一些具有與其他研究中表征的腫瘤特異性祖細胞 PD-1+ CD8+ T 細胞相似的轉錄表型，以 IL7R（CD127）、TOX 和 TCF7（TCF-1 ）的表達為標志 。 在腫瘤內的 PD-1+ CD8+ T 細胞中，IL7R 和 TCF7 在 CEFX 特異性細胞上的表達最高。
鑒于通過這種方法測試的已知微生物 T 細胞表位數量很少，并且循環和腫瘤浸潤 PD-1+ T 細胞之間的bystander 、非腫瘤特異性細胞的頻率相似，人腦轉移灶中總bystander 細胞的頻率可能要高得多。 此外，考慮到與腫瘤浸潤性終末分化細胞和循環細胞相比，metacluster B/C 中 CEFX 特異性細胞的富集，很可能metacluster B/C 中的許多細胞對非腫瘤抗原具有特異性并且不具有在腫瘤內產生具有終末分化表型的細胞。 雖然這些數據并不排除腦轉移灶中存在小的腫瘤特異性耗盡祖細胞群，但大部分腫瘤浸潤的 TCF-1+ CD8+ T 細胞似乎是非腫瘤抗原特異性的bystander 細胞。
CD8+ T cell phenotype is related to spatial distribution within the tumor
鑒于與腫瘤內的其他亞群相比，終末分化細胞的不同表型和抗原特異性，我們假設腦轉移浸潤 CD8+ T 細胞的每個亞群可能位于 TME 的不同區域內，因此從周圍組織接收不同的信號。 為了測試這一點，我們在六個腦轉移組織切片上進行了空間轉錄組學，一種原位測量基因表達的方法：一個黑色素瘤、一個腎細胞癌、一個乳腺癌和三個肺癌。 基于基因表達對捕獲點進行聚類，并且基于 H&E 染色中的外觀對每個聚類進行注釋。
腫瘤實質——指的是腫瘤細胞區域——和周圍的基質很容易通過它們的基因表達譜來區分。 對于腫瘤正常邊界清晰可見的切片，腫瘤實質和周圍基質之間差異表達的基因數量范圍為 3,914-7,480。 在腫瘤實質和基質混合的兩個樣本中，兩個區域之間差異表達的基因數量為637和2,327。 六個組織切片之一完全由腫瘤實質組成，排除了該分析。
TME 異質性和免疫浸潤之間的相互作用很明顯。在腎細胞癌病例中，腫瘤“small nests” ”的CD8A、CD8B和CD4表達密度高于腫瘤的“large nests” ”，血管周圍結締組織增生區域的轉錄水平甚至更高。此外，在腫瘤實質和腦組織可見的兩個肺癌樣本中，CD3E 轉錄水平在腫瘤與腦的界面處最高。在腫瘤實質被炎癥包圍的黑色素瘤腦轉移組織切片的示例中（患者 16），CD3E、CD4、CD8A 和 CD8B 轉錄本的密度在腫瘤周圍炎癥和直接相鄰的腫瘤實質中最高。總之，這些結果與之前的觀察結果一致，即與腫瘤核心相比，免疫細胞在腦轉移的外圍區域富集。 在黑色素瘤樣本中，與 CD8+ T 細胞的終末分化表型相關的基因表達，如 HAVCR2 (TIM-3)、LAG3、CXCL13 和 GZMB 在炎癥附近的腫瘤實質中最高，而祖標志物 TCF7 (TCF-1) 和 IL7R (CD127) 在炎癥基質中的表達最高，表明免疫細胞表型確定其在不同 TME 中的位置。在黑色素瘤樣本中，與 CD8+ T 細胞終末分化表型相關的基因，如 HAVCR2 (TIM-3)、LAG3、CXCL13 和 GZMB，在炎癥附近的腫瘤實質中表達最高。總之，這些數據表明 CD8+ T 細胞表型和腦轉移 TME 內的位置是相關的。
Terminally-differentiated CD8+ T cell clones are preferentially located in the tumor parenchyma
定義這些 CD8+ T 細胞表型的基因也可能由 TME 內的其他細胞表達，例如 CD4+ T 細胞。 因為已經證明腦轉移瘤中的 TCR 克隆受到表型限制——也就是說，表達單個 TCR 的細胞主要在 scRNA-seq metacluster A/D 或 B/C 內，但不是兩者——TCR 在腫瘤內的定位將允許腫瘤內特定 CD8+ T 細胞表型的可視化。 為了確定腦轉移 TME 中 CD8+ T 細胞是否存在空間限制，開發了一種從空間轉錄組學基因表達文庫中擴增 TCR 轉錄本的方法。 通過將空間轉錄組學和 scRNA-seq 數據中發現的 TCR 克隆聯系起來，我們可以確定具有特定轉錄表型的 CD8+ T 細胞在 TME 中的位置。
在對其進行空間轉錄組學的六個組織中，來自新鮮組織的 scRNA-seq 數據可用于兩個 - 患者 15 和 16，分別是肺癌和黑色素瘤樣本。 在黑色素瘤樣本（患者 16）中，我們觀察到具有 metacluster A/Dividing 表型的 CD8+ T 細胞克隆主要位于腫瘤實質中，而具有 metacluster B/C 表型的 CD8+ T 細胞克隆主要存在于腫瘤周圍炎癥中 . 不僅metacluster A/Dividing TCR 在腫瘤實質中富集，而且與具有metacluster B/C 表型的那些相比，在腫瘤外發現的具有這種表型的 TCR 克隆也優先位于更靠近腫瘤邊界的位置。 這些發現在肺癌腦轉移（患者 15）中得到證實，其中整個組織切片是腫瘤實質，僅由metacluster A/分裂細胞表達的 TCR 駐留。
鑒于 TME 內特定位置的特定 CD8+ T 細胞子集的這種偏好，我們試圖確定它們是否根據它們的位置接收不同的信號輸入。因此，比較了腫瘤不同空間基因表達cluster之間的轉錄譜。在腎細胞癌樣本（患者 24）中，基因表達因腫瘤結構而異：305 個基因在腫瘤的小巢和大巢之間差異表達。與大腫瘤巢相比，小腫瘤巢內的 MHC I 表達更高，這表明同一腫瘤內的 CD8+ T 細胞可能會根據它們在實質內的位置接受不同水平的 TCR 刺激。在黑色素瘤樣本（患者 16）中，564 個基因在炎癥附近的腫瘤區域和腫瘤實質的其余部分之間差異表達。與實質的其余部分相比，外周炎癥附近腫瘤中 MHC I 和 MHC II 的轉錄水平更高，這表明該區域腫瘤特異性細胞的 TCR 刺激最大。相反，在乳腺癌樣本（患者 24）中，MHC I 在包含腫瘤實質的捕獲點中高度下調，這可能表明該患者的 CD8+T 細胞的腫瘤相關抗原呈遞有限。在黑色素瘤樣本（患者 16）中，CXCL9、CXCL10、CXCL11 和 CXCL13 以及 TGF-β 在外周較高，這表明該區域的 T 細胞與更深瘤內 T 細胞相比受到獨特的趨化因子和細胞因子環境的影響。
大塊腫瘤實質和周圍組織之間細胞因子和趨化因子表達的差異也是明顯的。 例如，TGFB1（編碼 TGF-β）在三個樣品的基質中富集，而其受體主要在薄壁組織中表達更高。 IFN-γ 受體亞基 IFNGR2 在五個腫瘤中的四個的實質中升高。 VEGFA 和 VEGFB 在所有五種腫瘤的實質中均上調。 鑒于腫瘤中表型和克隆受限的 CD8+ T 細胞亞群的差異定位，我們的結果共同表明抗原信號（或缺乏）將這些不同的 CD8+ T 細胞亞群驅動到腦轉移內的特定壁龕，在那里它們接收明顯不同的信號輸入.
Discussion
在這項工作中，描述了人腦轉移的 CD8+ T 細胞浸潤，這是許多癌癥類型發病率和死亡率的重要原因。 維持大腦獨特的免疫特權環境的血腦屏障 (BBB) 似乎在腦轉移瘤中分解。 由此產生的血腫瘤屏障 (BTB) 具有更高的滲透性，但保留了 BBB 的一些特征，并因腫瘤類型而異。 盡管腦轉移瘤對 ICB 有一些反應，但理論上，BTB 創造的半特權免疫環境可以限制免疫細胞進入和/或維持進入腦轉移瘤 TME。 在這里，我們展示了人腦轉移瘤被 CD8+ T 細胞充分浸潤，盡管浸潤程度因患者而異。
我們發現與患者匹配的血液相比，不同的 CD8+ T 細胞亞群填充了腦轉移。腫瘤內的大多數 CD8+ T 細胞是 PD-1+，我們的 scRNA-seq 分析將這些 PD-1+ 細胞聚集成分裂和終末分化的細胞——它們是克隆相關的——以及兩個共享 TCR 重疊的不太耗竭的細胞亞群彼此但不與分裂或終末分化的細胞。總體而言，腫瘤浸潤和循環 PD-1+ CD8+ T 細胞之間的 TCR 重疊較低，這與 HPV+ 頭頸癌患者中明顯缺乏循環腫瘤特異性 CD8+ T 細胞一致。然而，消耗較少的腫瘤浸潤細胞確實與循環細胞有有意義的克隆重疊，而終末分化的腫瘤浸潤細胞則很少。值得注意的是，我們發現腦轉移瘤包含非腫瘤特異性 CD8+ T 細胞，這些細胞表達在耗盡的祖細胞群中也發現的標記物，并且在腫瘤浸潤和循環 PD-1+ CD8+ T 細胞中的頻率相似。最后，我們將這些表型和克隆受限的 CD8+ T 細胞與 TME 內的離散空間偏好聯系起來。與耗竭相關的 CD8+ T 細胞克隆在腫瘤實質內富集，其中局部細胞因子和趨化因子環境與周圍基質顯著不同，在那里發現耗竭的 CD8+ T 細胞克隆較少。基于這些發現，我們的數據支持一個模型，其中 CD8+ T 細胞以不依賴抗原的方式浸潤腦轉移的 TME。一旦 CD8+ T 細胞保留在腫瘤中，抗原信號或缺乏抗原信號就會促使 CD8+T 細胞募集到 TME 內的空間生態位。在每個 TME 生態位內，CD8+ T 細胞表型隨著來自周圍細胞因子環境的輸入而進化，并且取決于抗原特異性，持續的 TCR 刺激。
這項工作解決的一個關鍵問題是 TCF-1+ CD8+ T 細胞在人腦轉移中的作用。 TCF-1 在癌癥和慢性感染小鼠模型中的抗原特異性耗盡祖 CD8+ T 細胞上表達，并且 TCF-1 已被用作腫瘤免疫學研究中耗盡祖 CD8+ T 細胞的標志物。然而，TCF-1 也在其他 CD8+ T 細胞亞群上表達，例如幼稚細胞和記憶細胞。我們發現腦轉移灶中的少數 TCF-1+ CD8+ T 細胞共表達 TOX 和 PD-1，這兩種蛋白質也在耗盡的腫瘤特異性 CD8+ T 細胞上表達。至關重要的是，我們發現有Bystander細胞對滲入腦轉移灶的微生物抗原具有特異性，并且這些細胞的一個子集與耗盡的祖 CD8+ T 細胞共享表型特征 - 例如 TCF-1 表達。Bystander 克隆在循環和腫瘤浸潤的 PD-1+ CD8+ T 細胞中以相似的頻率存在。基于這些數據，我們提出腦轉移 TME 中的許多 TCF-1+ PD-1+ CD8+ T 細胞是Bystander 。由于細胞因子和促炎信號分子的表達增加，而不是通過抗原驅動的過程，這些細胞可能會被募集到腫瘤中。因此，腦轉移 TME 中 TCF-1+ CD8+ T 細胞密度的增加可能表明腫瘤更加發炎，而不是大量腫瘤特異性耗盡的祖 CD8+ T 細胞。
分析表明，較少消耗的腦轉移浸潤 CD8+ T 細胞優先保留在腫瘤實質周圍的基質中。相比之下，終末分化群體優先位于腫瘤實質內。鑒于Bystander 細胞（采用較少消耗的表型）和終末分化細胞之間的克隆重疊有限，很可能是抗原刺激將終末分化的 PD-1+ CD8+ T 細胞驅動到腫瘤實質。在腫瘤實質內，與基質內的 CD8+ T 細胞相比，這些細胞接收不同的信號輸入，可能促進它們獲得終末分化表型。例如，我們表明與基質相比，VEGF 表達在腫瘤實質中富集；已發現 VEGF 信號傳導可促進 CD8+ T 細胞上的 PD-1、CTLA-4、TIM-3 和 TOX 表達。這與我們在終末分化的 CD8+ T 細胞上觀察到的這些分子的更高表達一致。
在scRNA-seq 數據中鑒定的分裂 CD8+ T 細胞metacluster可以代表腫瘤特異性 TCF-1+ 耗盡祖細胞和終末分化細胞之間的中間分化狀態。人腦轉移瘤中的這些分裂細胞與暫時性抗原特異性 CD8+ T 細胞共享基因特征，CD8+ T 細胞是 T 細胞耗竭的 LCMV 小鼠模型中淋巴駐留的衰竭祖細胞和非淋巴駐留的終末分化細胞之間的中間分化狀態.在小鼠腫瘤模型中的工作表明，腫瘤特異性耗盡的祖 CD8+ T 細胞存在于腫瘤引流淋巴結中，并且它們與腫瘤浸潤、終末分化的 CD8+ T 細胞克隆相關。此外，在小鼠模型中維持抗原特異性 CD8+ T 細胞需要淋巴結駐留祖細胞遷移到腫瘤；瘤內 TCF-1+ 腫瘤特異性細胞不是自我維持的群體。在轉移性癌癥的情況下，根據疾病的負擔，可能有許多腫瘤引流淋巴結的解剖部位，所有這些部位都可能含有腫瘤特異性耗盡的祖 CD8+T 細胞。最近描述了一種引流大腦的淋巴系統，并表明頸部淋巴結也可以作為腦轉移特異性祖細胞 CD8+ T 細胞的儲存庫。我們的數據并不排除在腦轉移 TME 中存在少量腫瘤特異性祖細胞耗竭 CD8+ T 細胞，但表明這些其他位點可能是腫瘤特異性耗竭祖細胞的重要儲存庫。
Our findings have a number of therapeutic implications. First, the dense infiltration of brain metastases by CD8+ T cells provides a rational basis for the use and development of immunotherapies in the brain metastasis setting. Next, our data support the use of combination therapies with PD-1 pathway blockade to enhance rescue of exhausted, tumor-specific CD8+ T cells by targeting additional inhibitory molecules expressed on brain metastasis-infiltrating terminally-differentiated CD8+ T cells, such as CTLA-4 and LAG3. These terminally-exhausted CD8+ T cells within the TME may re-gain effector function with PD-1 blockade and/or combination therapies that lead to enhanced tumor cell killing. Finally, targeting the unique signaling niches in which brain metastasis-infiltrating CD8+ T cells reside provides an additional opportunity to harness the immune system to improve disease control in the brain. Together our findings support the continued development of immunotherapeutic strategies that harness the anti-tumor efficacy of brain metastasis- infiltrating CD8+ T cells.
Method（主要是空間上尋找TCR克隆的方法）
Spatial transcriptomics，看來空間上的TCR克隆也是空間轉錄組文庫的特異性PCR，這個可以參考我之前分享的文章10X空間轉錄組技術創新之同時測RNA和TCR（BCR）
生活很好，有你更好
