hello，大家好，今天我們繼續(xù)分享單細(xì)胞空間的分析內(nèi)容，不過我們今天重點(diǎn)放在免疫部分，參考文獻(xiàn)在Resident memory CD8⁺ T cells in regional lymph nodes mediate immunity to metastatic melanoma，2021年9月發(fā)表于Immunity,IF37分，專門針對(duì)免疫研究的文章，我們今天來好好看看，看看作者是如何將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、VDJ、空間三項(xiàng)技術(shù)整合在一起攻克生物學(xué)難題的。

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研究人員利用黑色素瘤相關(guān)的白癜風(fēng)小鼠模型研究了常駐記憶（T_rm）和循環(huán)記憶（T_cirm）細(xì)胞在轉(zhuǎn)移位置的抗腫瘤反應(yīng)中的作用。研究人員發(fā)現(xiàn)，腫瘤特異性CD8⁺ T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征是由占據(jù)的組織決定的。異種共生表明，腫瘤特異性的Trem和Tcirm區(qū)段在整個(gè)內(nèi)臟器官中持續(xù)存在，但Trem細(xì)胞在淋巴結(jié)（LN）中占主導(dǎo)地位。淋巴結(jié)和皮膚中Trem細(xì)胞的單細(xì)胞RNA測(cè)序圖譜是不同的，占據(jù)這兩種組織的T細(xì)胞克隆型在淋巴結(jié)中絕大部分保持為Trem細(xì)胞。

雖然Tcirm細(xì)胞阻止了黑色素瘤在肺部的生長(zhǎng)，但Trem對(duì)黑色素瘤在LN的播種提供了長(zhǎng)期的保護(hù)。擴(kuò)大的Trem population也存在于黑色素瘤患者的LN中，其轉(zhuǎn)錄特征預(yù)示著更好的生存。因此，腫瘤特異性Tram細(xì)胞在LN中持續(xù)存在，從而限制了轉(zhuǎn)移性癌癥。

In brief

Lymph nodes (LNs) are frequent sites of metastasis. Molodtsov, Khatwani et al. find that melanoma-specific CD8⁺ T cells persist as functional resident memory (T_rm) populations within skin-draining LNs, and these T_rm cells prevent melanoma growth upon tumor seeding in LNs. A LN T_rm transcriptional signature predicts survival in melanoma patients, highlighting the relevance of LN T_rm function in human disease.

Highlights

• Tissue localization defines the transcriptional profile of tumor-specific CD8⁺ T cells
• Melanoma-specific T_rm populations develop in skin-draining lymph nodes
• T_rm cells protect against melanoma tumor seeding in lymph nodes
• A lymph node T_rm transcriptional signature uniquely predicts survival in melanoma patients

SUMMARY

隨著原發(fā)性腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，抗腫瘤免疫反應(yīng)的性質(zhì)會(huì)發(fā)生變化。研究使用黑色素瘤相關(guān)白斑的小鼠模型研究了resident memory (T_rm) 和circulating memory (Tcirm) 細(xì)胞在轉(zhuǎn)移部位的抗腫瘤反應(yīng)中的作用。發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征由占據(jù)的組織defined。Parabiosis顯示腫瘤特異性 T_rm 和 Tcirm compartments在整個(gè)內(nèi)臟器官中持續(xù)存在，但 T_rm 細(xì)胞主導(dǎo)淋巴結(jié) (LN)。 LN 和皮膚中 T_rm 細(xì)胞的單細(xì)胞 RNA 測(cè)序譜是不同的，占據(jù)兩種組織的 T 細(xì)胞克隆型在 LN 中絕大多數(shù)保持為 T_rm。 Tcirm 細(xì)胞阻止黑色素瘤在肺部的生長(zhǎng)，而 T_rm 提供了針對(duì) LN 中黑色素瘤seeding的長(zhǎng)期保護(hù)。來自患者的黑色素瘤相關(guān)淋巴結(jié)中也存在擴(kuò)大的 T_rm population，它們的轉(zhuǎn)錄特征預(yù)測(cè)了更好的存活率。因此，腫瘤特異性 T_rm 細(xì)胞在 LN 中持續(xù)存在，限制了轉(zhuǎn)移性癌癥。（T細(xì)胞的分類實(shí)在太多了一些）

INTRODUCTION

轉(zhuǎn)移是癌癥死亡的主要原因，盡管對(duì)轉(zhuǎn)移部位的免疫反應(yīng)尚不清楚。 CD8⁺ T 細(xì)胞充當(dāng)小鼠早期癌癥的守護(hù)者，抑制癌細(xì)胞的擴(kuò)散，T 細(xì)胞激活免疫檢查點(diǎn)抑制劑藥物對(duì)廣泛轉(zhuǎn)移性疾病的患者有效。 記憶 T 細(xì)胞對(duì)于對(duì)癌癥的持久免疫特別重要，并且與患者的較低轉(zhuǎn)移率有關(guān)。
盡管作為 T 細(xì)胞啟動(dòng)的必要器官，淋巴結(jié) (LN) 卻是最常見的早期轉(zhuǎn)移部位。 Tumor-draining的 LN 變得高度免疫抑制，并且 LN 脈管系統(tǒng)獨(dú)特地能夠?qū)⒛[瘤細(xì)胞傳播到遠(yuǎn)處器官。將 LN 指定為轉(zhuǎn)移的途徑強(qiáng)調(diào)了了解 LN 局部對(duì)癌癥的免疫的必要性。 這種免疫的存在是通過以下發(fā)現(xiàn)來推斷的：一些轉(zhuǎn)移瘤從未擴(kuò)散到 LN 的包膜下區(qū)域之外，并且全區(qū)域淋巴結(jié) (RLN) 切除對(duì)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者缺乏治療益處。
在 LN 中啟動(dòng) CD8⁺ T 細(xì)胞后，克隆擴(kuò)增的population分化為循環(huán)和常駐記憶亞群。循環(huán)記憶 (Tcirm) 細(xì)胞——包括中樞 (Tcm)、效應(yīng)細(xì)胞 (Tem) 和干細(xì)胞記憶 (Tscm) 亞群——通過血液和淋巴器官再循環(huán)，而常駐記憶 (T_rm) 細(xì)胞群在組織中穩(wěn)定駐留。與 Tcirm 細(xì)胞相反，T_rm 細(xì)胞表達(dá)組織保留標(biāo)志物，缺乏egress markers的表達(dá)，并且在功能上被定義為它們無法在穩(wěn)定狀態(tài)下再循環(huán)。 T_rm 細(xì)胞存在于整個(gè)組織中，包括皮膚、肺、肝、腦、腸和生殖道，在這些組織中它們提供了抵御外周再感染和癌癥的屏障。此外，CD8⁺ T_rm 細(xì)胞也可以占據(jù) RLN。在人類免疫缺陷病毒 (HIV) 感染的患者中，HIV 特異性 CD8⁺ T_rm 細(xì)胞在elite controllers的 LN 中富集，表明 LN T_rm 細(xì)胞在對(duì)抗感染中的作用。
Tcirm 和 T_rm 細(xì)胞介導(dǎo)的癌癥免疫研究主要集中在原發(fā)性腫瘤上，而對(duì)轉(zhuǎn)移部位的memory requirements知之甚少。 之前的工作揭示了皮膚 T_rm 細(xì)胞在小鼠皮膚黑色素瘤的長(zhǎng)期保護(hù)中的關(guān)鍵作用。 其他研究人員已經(jīng)表明需要 T_rm 細(xì)胞對(duì)抗粘膜部位的腫瘤，盡管 T_rm 和 Tcm 細(xì)胞之間的相互作用在其他情況下可能至關(guān)重要。 腫瘤內(nèi) CD103⁺ T_rm 樣細(xì)胞與改善預(yù)后和增強(qiáng)免疫治療反應(yīng)相關(guān)。 然而，Tcirm 細(xì)胞也與改善的結(jié)果有關(guān)。 Tcirm 和皮膚 T_rm population共同構(gòu)成了患有白斑病的黑色素瘤幸存者的持久免疫治療反應(yīng)的基礎(chǔ)。
在這里，分析使用已建立的黑色素瘤長(zhǎng)壽命免疫模型和相關(guān)自身免疫檢查了 T_rm 細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)移部位黑色素瘤免疫的貢獻(xiàn)。 T_rm 和 Tcirm compartments均在整個(gè)淋巴和內(nèi)臟轉(zhuǎn)移部位產(chǎn)生，但與受 Tcirm 細(xì)胞有效保護(hù)的肺不同，RLN 中的腫瘤保護(hù)主要由轉(zhuǎn)錄上不同的 LN T_rm 細(xì)胞群提供。 這些研究表明，腫瘤位置定義了保護(hù)性記憶反應(yīng)的最佳特征，并表明 T_rm 細(xì)胞是 LN 內(nèi)癌癥免疫的關(guān)鍵介質(zhì)。

RESULTS

Tissue location dictates the transcriptional characteristics of tumor-specific memory T cells

為了研究 CD8⁺ T 細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)移部位腫瘤的反應(yīng)，利用已建立的手術(shù)后黑色素瘤相關(guān)白斑 (MAV) 小鼠模型。 為了響應(yīng) B16 真皮腫瘤生長(zhǎng)和用抗 CD4 治療以消耗 Treg 細(xì)胞，小鼠打破了對(duì)黑素細(xì)胞分化抗原 gp100 和 TRP-2 的耐受性。 在手術(shù)切除原發(fā)腫瘤后，這些小鼠會(huì)發(fā)展為自身免疫性白癜風(fēng)，這是維持 LN 和皮膚中針對(duì) gp100 和 TRP-2 的記憶 CD8⁺ T 細(xì)胞反應(yīng)所必需的。 在患有 MAV 的小鼠中，黑色素瘤保護(hù)在dermis中持續(xù)存在，并防止肺部靜脈注射 (i.v.) 再激發(fā)。 皮膚腫瘤保護(hù)由皮膚中的 T_rm 細(xì)胞提供。 為了識(shí)別其他組織中的腫瘤抗原特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞，在 MAV 誘導(dǎo)之前引入了 10⁴ 個(gè)初始 pmel 細(xì)胞的示蹤population。 這些sentinel pmel 細(xì)胞反映了 MAV 小鼠的內(nèi)源性 CD8⁺ T 細(xì)胞反應(yīng)。
在腫瘤切除當(dāng)天評(píng)估啟動(dòng)，抗原經(jīng)歷 (CD44^hi) pmel 細(xì)胞已經(jīng)分布在整個(gè)組織中。 正如預(yù)期的那樣，在皮膚中檢測(cè)到最高的 pmel 比例。 然而，pmel 細(xì)胞也在肺、肝和淋巴結(jié)中大量積累。 四十五天后，整個(gè)組織中的記憶群仍然很明顯。 在灌注的肺和肝臟中，體內(nèi) mAb 染色揭示了實(shí)質(zhì)和血管相關(guān) pmel 記憶群的存在。 相對(duì)于啟動(dòng)，脾、肺和肝臟的記憶反應(yīng)收縮，盡管它們?cè)?LN 中保持不變，并在自身免疫性皮膚中膨脹。 因此，在存在皮膚局部自身免疫的情況下，在宿主淋巴組織和內(nèi)臟器官中形成了強(qiáng)大的腫瘤特異性 T 細(xì)胞記憶。
然后，使用 CD103⁺CD69⁺CD62L^lo 皮膚 T_rm 細(xì)胞作為參考population評(píng)估了記憶時(shí)組織定位的 pmel 細(xì)胞的表型。 雖然 CD103 和 CD69 在皮膚的 pmel 細(xì)胞上表達(dá)最強(qiáng)，但它們?cè)?LN 中也高度表達(dá)。 脾臟、肺和肝臟中的 Pmel 細(xì)胞也表達(dá) CD103 和 CD69，但水平低于皮膚或淋巴結(jié)。 CD62L 在所有組織中的 pmel 細(xì)胞中基本上不存在，證實(shí)該模型中不存在穩(wěn)健的 Tcm compartment。 CD103⁺CD69⁺CD62L^lo T_rm 表型是 MAV 環(huán)境中 pmel 細(xì)胞所獨(dú)有的，因?yàn)樗c過繼轉(zhuǎn)移之前的幼稚 pmel 細(xì)胞不同，并且與在表達(dá) gp100 的單純皰疹病毒感染背景下產(chǎn)生的 pmel 記憶群不同 . 因此，腫瘤特異性記憶 T 細(xì)胞在所有組織位置表達(dá) T_rm 標(biāo)志物，盡管水平不同。
為了識(shí)別不同位置的腫瘤特異性 T 細(xì)胞之間的差異，從不同組織中分選 pmel 細(xì)胞并通過bulk RNA-seq 進(jìn)行分析。對(duì)組織間表達(dá)差異最大的轉(zhuǎn)錄物的分析揭示了組織特異性轉(zhuǎn)錄特征。皮膚中的 Pmel 細(xì)胞表達(dá)最高水平的 Atf3、Zfp36 和 Fabp4/5，后者對(duì)于皮膚中的 T_rm 代謝至關(guān)重要。另一方面，來自肺的 pmel 細(xì)胞表達(dá) Gzma、Itgax (CD11c) 和 Fabp3。這與肝臟形成對(duì)比，肝臟中細(xì)胞表達(dá) Fabp1 和 Fabp7，前者促進(jìn)肝臟中的 T_rm 細(xì)胞維持。來自 LN 的 pmel 細(xì)胞表達(dá)與 IL-7 信號(hào)（例如，Il7r、Stat5a 和 Bcl2）和 1 型 IFN 信號(hào)（例如，Stat1 和 Irf3）相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本。在啟動(dòng)/效應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取自 LN 的效應(yīng) (Teff) pmel 細(xì)胞中未觀察到這種特征，表明它是記憶所獨(dú)有的。因此，克隆相同的記憶 T 細(xì)胞群采用基于其占據(jù)組織的獨(dú)特基因表達(dá)譜。
為了更好地了解組織內(nèi)記憶 T 細(xì)胞亞群的分化，關(guān)注與 T_rm、激活/效應(yīng)子和 Tcirm 亞群相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本。對(duì)于 標(biāo)記，初始 pmel 細(xì)胞或腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞 (TIL) 為低轉(zhuǎn)錄本或缺失轉(zhuǎn)錄本提供了T_rm參考。正如預(yù)期的那樣，來自皮膚的 pmel 細(xì)胞表現(xiàn)出 T_rm 轉(zhuǎn)錄本的顯著表達(dá)，因此缺乏大多數(shù) Tcirm 轉(zhuǎn)錄本，而這些轉(zhuǎn)錄本由對(duì)照naive (CD44lo) pmel 細(xì)胞高度表達(dá)。皮膚 pmel 細(xì)胞也表達(dá)了高水平的激活/耗竭轉(zhuǎn)錄本，這些轉(zhuǎn)錄本在 TIL 中高度表達(dá)。這與來自脾臟的 pmel 細(xì)胞不同，后者表達(dá)較低水平的大多數(shù) T_rm 和激活/耗竭轉(zhuǎn)錄本，同時(shí)表達(dá)高水平的幾種 Tcirm 轉(zhuǎn)錄本。另一方面，肺、肝和淋巴結(jié)中的 pmel 細(xì)胞通過已知特征不太清楚。盡管這些population中的每一個(gè)都表達(dá)了高水平的多個(gè) T_rm 標(biāo)記，但它們同時(shí)表達(dá)了中等水平的激活/耗竭標(biāo)記和中等或高水平的幾個(gè) Tcirm 轉(zhuǎn)錄本。因此，即使在單個(gè)組織位置，腫瘤特異性記憶 T 細(xì)胞的異質(zhì)population也存在于克隆一致的population中。

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Tumor-specific CD8⁺ T cells differentiate into T_rm populations within LNs and lungs

為了最終確定單個(gè)組織中 T_rm 和 Tcirm subset的存在，進(jìn)行了共生研究。 含有記憶 pmel 示蹤劑population的 MAV 供體小鼠與具有同類標(biāo)記的 MAV 受體共生結(jié)合 14 天。 這足以建立血管吻合，在第 30 天時(shí)不會(huì)進(jìn)一步增加。考慮到總 CD8⁺ T 細(xì)胞，初始 (CD44^lo) 和記憶 (CD44^hi) compartments的平衡在連體小鼠的脾臟、LN 和肺中都很明顯。 盡管有大量的內(nèi)源性 T_rm population，但肝臟也達(dá)到了平衡。 皮膚 CD8⁺ T 細(xì)胞未能平衡，這與受白癜風(fēng)影響的皮膚中存在 T_rm 細(xì)胞一致。
正如預(yù)期的那樣，專注于 Ag 特定的 pmel population，在皮膚中沒有觀察到平衡。 然而，脾臟中的 pmel 細(xì)胞完全平衡，表明它們的身份為 Tcirm，這與它們通過bulk RNA-seq 表達(dá)的組織出口分子一致。 相比之下，肺 pmel 細(xì)胞僅部分平衡，表明它們包含 Tcirm 和 T_rm subset。 此外，再循環(huán)肺population的表型主要是 CD103loCD62Llo，與這些細(xì)胞是 Tem 一致。 受體小鼠肝臟中的 Pmel 種群小于供體，表明 Tcirm 細(xì)胞在肝臟中普遍存在，但不排除 T_rm 亞群的存在。 總之，這些數(shù)據(jù)表明腫瘤特異性 T_rm 和 Tcirm 細(xì)胞的組合占據(jù)了 MAV 小鼠的內(nèi)臟器官。
出乎意料的是，共生研究進(jìn)一步揭示了 LN 中存在大量腫瘤特異性 T_rm population。大多數(shù) pmel 細(xì)胞未能在腹股溝淋巴結(jié)中平衡，并保留在具有 CD103^hiCD62L^low 表型的供體中。在 LN 中僅檢測(cè)到少量再循環(huán)部分，其特征在于 CD103^loCD62L^hi/lo 表型。 LN T_rm 種群隨著時(shí)間的推移是穩(wěn)定的，這表明即使在 30 天的共生之后也達(dá)到最小平衡。使用naive受體交替進(jìn)行聯(lián)體共生導(dǎo)致類似的結(jié)果，表明受體小鼠的白斑病既不阻止也不促進(jìn) pmel T 細(xì)胞駐留或再循環(huán)。所有引流皮膚的 LN 都含有 pmel T_rm 群，而腸系膜 LN 完全缺乏 pmel 細(xì)胞，這表明靠近皮膚可能對(duì) LN 中的 T_rm 建立很重要。在引流先前腫瘤切除部位的 RLN 中觀察到最大的population。在這里，大多數(shù) pmel 細(xì)胞是 T_rm，但也有少量的再循環(huán)細(xì)胞群。這些研究揭示了以前未被重視的腫瘤特異性 T_rm 細(xì)胞群的存在，這些 T_rm 細(xì)胞在 LN 中持久存在。

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Transcriptional single-cell analysis reveals diverse memory T cell populations throughout tissues(轉(zhuǎn)錄單細(xì)胞分析揭示了整個(gè)組織中不同的記憶 T 細(xì)胞群)

為了更好地表征 T_rm 和 Tcirm population的異質(zhì)性，使用 10X 平臺(tái)通過單細(xì)胞 RNA 測(cè)序 (scRNA-seq) 分析從不同組織中分選的 pmel T 細(xì)胞。 Pmel 細(xì)胞根據(jù)它們的起源組織清晰地聚集在一起，除了一個(gè)包含來自所有組織的細(xì)胞的混合小cluster。一般來說，scRNA-seq 的標(biāo)記表達(dá)與流式細(xì)胞術(shù)和批量 RNA-seq 一致。正如預(yù)期的那樣，來自皮膚的細(xì)胞表達(dá) T_rm 標(biāo)記（例如，Itgae、Cd69、CXCR6 和 NR4A1）并且缺乏 Tcirm 標(biāo)記（例如，Klf2 和 S1pr1）。根據(jù) Stmn1、Mki67 和 Mcm3 等基因的表達(dá)推斷，混合cluster包含增殖細(xì)胞。來自皮膚和肝臟的細(xì)胞各自形成單一的同質(zhì)cluster。從皮膚中分離出的 pmel 細(xì)胞重新聚集幾乎沒有異質(zhì)性，所有細(xì)胞都具有 T_rm 特征，與它們的共生行為一致。然而，肝臟的重新聚類揭示了兩個(gè)通過 Klf2 表達(dá)區(qū)分的cluster，表明肝臟中同時(shí)存在 Tcirm 和 T_rm 亞群。
即使聚集在更大的數(shù)據(jù)集中，肺和淋巴結(jié)中的 Pmel T 細(xì)胞也是異質(zhì)的。 Lung 包含三個(gè)clusters，Lung_1 和 Lung_2 均表達(dá) Tcirm 相關(guān)轉(zhuǎn)錄本 S1pr1 和 Klf2，以及高水平的 Gzma 和 Gzmb。 較小的 Lung_3 cluster表達(dá) Bcl2、Bbc3、Pim2 和 Ddit3，類似于最近報(bào)道的肺氣道 T_rm特征。 因此，與共生數(shù)據(jù)一致，肺具有轉(zhuǎn)錄不同的 T_rm 和 Tcirm populations。 值得注意的是，肺和肝 Tcirm 樣細(xì)胞群在轉(zhuǎn)錄上是不同的，這表明它們并不代表來自血液的污染物，而是 Tcirm 細(xì)胞與組織相互作用到一定程度改變了它們的轉(zhuǎn)錄譜。
LN 還包含三個(gè)cluster。 LN_1 是最小的，表達(dá) Cd28、Klf2、Slamf6、Tcf7 和 Tox，但缺乏 Itgae，與循環(huán) Tscm 樣或祖細(xì)胞耗竭細(xì)胞一致。 相比之下，較大的 LN_2 和 LN_3 cluster具有高 Itgae 和 Cxcr6 以及低 Klf2 和 S1pr1，使它們與 LN Trm cluster對(duì)齊。 與皮膚 Trm 細(xì)胞不同，LN Trm 細(xì)胞缺乏 Nr4a1、Fos 和 Tnf，而是表達(dá)高 Il7r、Lta 和 Cxcr3。 有趣的是，LN_2 與 LN_3 僅通過與 1 型 IFN 信號(hào)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)來區(qū)分，這與大量 RNA-seq 數(shù)據(jù)一致，并表明 LN_2 是暴露于 1 型 IFN 的 Trm 亞群。 因此，在 LN 中的腫瘤特異性記憶 T 細(xì)胞克隆群中存在轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性。
為了識(shí)別組織中記憶clusters之間的轉(zhuǎn)錄相似性，使用 Monocle 進(jìn)行偽時(shí)間排序。 populations形成了三個(gè)不同的分支，肺和肝在很大程度上重疊，與皮膚或 LN 不同。Based on distance and trajectories, the main LN Trm cluster (LN_3) appeared most similar to skin Trm cells, with the LN Tcirm cluster being more distinct。 然而，基于 RNA 速度分析，皮膚和 LN Trm populations之間不存在明顯的分化關(guān)系。 因此，雖然 LN 和皮膚population共享多個(gè)特征，但 LN Trm 細(xì)胞是轉(zhuǎn)錄上不同的記憶populations。

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這里多說一句，氣泡圖有負(fù)值，說明是對(duì)基因表達(dá)值標(biāo)準(zhǔn)化后繪制的結(jié)果。

LN Trm cells are functional, prevalent, and present in the endogenous T cell compartment

在先前腫瘤切除的 RLN 引流部位內(nèi)更仔細(xì)地檢查了腫瘤特異性 T 細(xì)胞的定位和表型特征。 RLN 的免疫熒光顯微鏡顯示 pmel T 細(xì)胞定位在 T 細(xì)胞區(qū)內(nèi)，類似于naive和 Tcm 細(xì)胞。 然而，在包膜下竇中表達(dá) CD169 的巨噬細(xì)胞附近的cluster中也觀察到細(xì)胞，這與病毒感染模型中的 LN Trm 定位一致。 T 細(xì)胞區(qū)和包膜下竇內(nèi)的 Pmel 種群表達(dá) CD103，表明 Trm 種群在整個(gè) LN 中的分布。
基于測(cè)序和共生數(shù)據(jù)，LN Trm 細(xì)胞通過 CD103 表達(dá)與其 LN Tcirm 對(duì)應(yīng)物區(qū)分開來。 為了定義額外的表型特征，分析了表征來自 scRNA-seq 數(shù)據(jù)的 LN Trm cluster的標(biāo)記的表面表達(dá)。 IL-7R (CD127)、CXCR6 和 CXCR3 的顯著更高表面表達(dá)將 CD103⁺ Trm 細(xì)胞與 LN 中的 CD103- Tcirm 對(duì)應(yīng)物區(qū)分開來。 為了解決這些亞群之間功能性的潛在差異，在 MAV 誘導(dǎo)之前，小鼠被過繼轉(zhuǎn)移了表達(dá) IRES-eYFP IFNg 報(bào)告基因的 pmel 細(xì)胞。 引人注目的是，對(duì)未再刺激細(xì)胞的快速離體分析表明，盡管 CD103^-Tcirm 亞群中明顯不存在，但 IFNg 在 LN 中的 CD103⁺ Trm 細(xì)胞中的表達(dá)一致高。 這些數(shù)據(jù)突出了 LN Trm 細(xì)胞作為表型和功能不同的腫瘤特異性 T 細(xì)胞群，準(zhǔn)備在 LN 內(nèi)發(fā)揮效應(yīng)子功能。

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LN Trm cells mediate long-lived immunity to melanoma in RLNs

白癜風(fēng)與轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的持久免疫治療反應(yīng)和良好預(yù)后密切相關(guān)。因此，患有 MAV 的小鼠在真皮和肺中維持針對(duì)黑色素瘤再攻擊的長(zhǎng)期保護(hù)性免疫。為了確定該模型中保護(hù)性記憶的完整程度，在原發(fā)腫瘤切除后至少 30 天，通過多種途徑進(jìn)行 B16 黑色素瘤再激發(fā)。為了僅評(píng)估宿主內(nèi)源性免疫，這些再攻擊研究中未使用 pmel 細(xì)胞。除了表現(xiàn)出強(qiáng)大的 CD8⁺ T 細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)尾靜脈再攻擊的保護(hù)作用，尾靜脈再攻擊會(huì)在肺中產(chǎn)生類似轉(zhuǎn)移的疾病，MAV 小鼠還通過門靜脈途徑獲得顯著保護(hù)，防止再攻擊，門靜脈途徑在肝臟中播種黑色素瘤。此外，還針對(duì)在先前腫瘤生長(zhǎng)部位直接注入 RLN 中的黑色素瘤細(xì)胞提供保護(hù)。與肺部一樣，LN 中的腫瘤保護(hù)是由 CD8⁺ T 細(xì)胞介導(dǎo)的，并且在接種多達(dá) 50,000 個(gè) B16 細(xì)胞后觀察到。因此，攜帶 MAV 的小鼠在內(nèi)臟器官和 RLN 內(nèi)持續(xù)對(duì)黑色素瘤提供廣泛的保護(hù)。
考慮到發(fā)現(xiàn)肺和 LN 都含有異質(zhì)性的 Trm 和 Tcirm 細(xì)胞群，目前尚不清楚這些細(xì)胞群中的哪一個(gè)在每個(gè)位置介導(dǎo)了長(zhǎng)壽命的保護(hù)性免疫。為了解決這個(gè)問題，將帶有 MAV 的小鼠與幼稚的受體共生化，以使 Tcirm 平衡 14 天。然后在同一天通過手術(shù)將小鼠分開并單獨(dú)重新攻擊，通過尾靜脈或直接進(jìn)入 RLN 中的 B16 細(xì)胞。再次嘗試后共生化供體和受體小鼠的肺對(duì)靜脈注射表現(xiàn)出類似的抵抗力，說明 Tcirm 細(xì)胞足以針對(duì)肺部轉(zhuǎn)移樣疾病的保護(hù)性免疫。這也說明保護(hù)性 Tcirm populations可以有效地轉(zhuǎn)移到?jīng)]有白斑的受體。無論如何，在共生受體小鼠中不存在對(duì) LN 再攻擊的保護(hù)，這表明 RLN 中的腫瘤保護(hù)需要 Trm 細(xì)胞。因此，Tcirm 和 Trm 細(xì)胞共同為轉(zhuǎn)移部位的黑色素瘤提供保護(hù)，LN Trm 細(xì)胞為 RLN 內(nèi)的黑色素瘤生長(zhǎng)提供了屏障。

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為了明確確定人類中 LN Trm populations的存在，對(duì)來自轉(zhuǎn)移性疾病患者手術(shù)收獲的黑色素主要參與的 LN 的 T 細(xì)胞進(jìn)行了 scRNA-seq 和配對(duì) scTCR-seq。 對(duì)分選的人類 CD8⁺ T 細(xì)胞的分析揭示了四個(gè)轉(zhuǎn)錄cluster，其中一個(gè) (HuLN_1) 表現(xiàn)出 Trm 細(xì)胞的顯著特征。 此外，該樣本中擴(kuò)增最多的前五個(gè)克隆型富集在 Trm cluster中，表明這些人 LN Trm 細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)行了克隆擴(kuò)增。 這些結(jié)果共同證實(shí)了患者中 LN Trm populations的存在。

研究 LN Trm 細(xì)胞在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者中的潛在預(yù)后意義，基于 pmel LN Trm cluster中相對(duì)于其他人群表達(dá)差異最大的基因產(chǎn)生了轉(zhuǎn)錄特征。生成皮膚-Trm 和肺-T_CIRCM 特征用于比較。然后使用這些特征來推斷來自癌癥基因組圖譜 (TCGA) 的黑色素瘤樣本中記憶性 T 細(xì)胞的富集。評(píng)估 TCGA 中的所有黑色素瘤樣本，所有三個(gè)特征都具有顯著的預(yù)后價(jià)值。然而，當(dāng)僅分析 RLN 轉(zhuǎn)移性黑色素瘤標(biāo)本時(shí)，LN-Trm 特征的富集提供了最強(qiáng)的預(yù)后益處，LN-T_rm^hi 患者的中位總生存期比具有其他特征的隊(duì)列長(zhǎng)至少 670 天。這種相關(guān)性在兩個(gè)獨(dú)立的黑色素瘤 RLN 轉(zhuǎn)移數(shù)據(jù)集中得到證實(shí)，即使從特征中排除 CD8⁺ T 細(xì)胞特異性基因（Cd8a、Cd8b1、Cd3g、Cd3e 和 Trav7-4）也沒有改變。此外，通過 Cox 多變量分析，LN Trm 特征的富集是轉(zhuǎn)移性黑色素瘤標(biāo)本中唯一重要的保護(hù)特征。因此，Trm populations存在于黑色素瘤浸潤(rùn)的 LN 中，它們的轉(zhuǎn)錄特征獨(dú)特地預(yù)測(cè)了患者的更好結(jié)果。

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DISCUSSION

產(chǎn)生持久的宿主范圍抗癌免疫是該領(lǐng)域的基本目標(biāo)。 最近對(duì)患者進(jìn)行免疫治療的成功表明，這種結(jié)果是可能的，但癌癥會(huì)轉(zhuǎn)移到不同的組織位置，并且 T 細(xì)胞必須能夠進(jìn)入、占據(jù)并在這些環(huán)境中發(fā)揮作用。 本研究為支持這些功能的 T 細(xì)胞多樣性提供了新的見解。 通過產(chǎn)生循環(huán)和組織駐留記憶subsets，克隆相同的 CD8⁺ T 細(xì)胞群形成一個(gè)巨大的網(wǎng)絡(luò)，賦予整個(gè)宿主保護(hù)性免疫。 分析闡明了引流 LN 內(nèi)腫瘤排斥的鮮為人知的現(xiàn)象，我們表明 Trm 細(xì)胞是早期轉(zhuǎn)移的這個(gè)關(guān)鍵部位腫瘤免疫的主要介質(zhì)。
我們的研究證明了結(jié)合表型分析、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和體內(nèi)功能分析的關(guān)鍵價(jià)值，以揭示離散記憶 T 細(xì)胞亞群的身份。只有通過聯(lián)體共生、流式細(xì)胞術(shù)和單細(xì)胞 RNA-seq 的組合，我們才能確定和有效地辨別記憶 T 細(xì)胞亞群的特性。盡管之前人們認(rèn)識(shí)到 Trm 細(xì)胞根據(jù)組織位置采用獨(dú)特的特征，但我們的研究揭示了這些精確的變化，并表明它們可以由腫瘤特異性 T 細(xì)胞的克隆群產(chǎn)生。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示了宿主范圍內(nèi)抗腫瘤反應(yīng)的異質(zhì)性。腫瘤特異性 Trm 細(xì)胞在 LN 中形成了一個(gè)離散的記憶群，具有獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄特性。這些特性具有預(yù)后意義，例如它們具有預(yù)測(cè)具有 RLN 轉(zhuǎn)移的黑色素瘤患者生存的卓越能力。由于先前對(duì) LN Trm 反應(yīng)的研究?jī)H限于病毒感染的環(huán)境，我們?cè)谶@里的工作顯示了這種現(xiàn)象在腫瘤免疫和自身免疫中的重要方面。除了它們的 CD69⁺CD62L_lo 表型外，腫瘤特異性 LN Trm 細(xì)胞在高 Itga1 和 Xcl1 和低 Sell、S1pr1、Klf2 和 Nr4a1 的表達(dá)方面與病毒特異性 LN Trm 相似。 LN Trm population也由高 Itgae 和 Cxcr6 表達(dá)定義，這在 Beura 等人中未觀察到。阿爾。但在來自 HIV 患者的 CD69⁺ LN Trm 細(xì)胞中很突出。
皮膚中克隆相同的 Trm 細(xì)胞與皮膚引流 LN 之間的關(guān)系仍有待辨別。雖然與皮膚 Trm 細(xì)胞共享許多特征，但 LN Trm 細(xì)胞缺乏 AP-1 家族、Nr4a 家族和 Fabp4/5 轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)。相反，它們表達(dá)了高水平的 IL-7R（已知它支持記憶性 T 細(xì)胞維持）和 1 型 IFN 信號(hào)的標(biāo)記物，后者可以通過增加 CD69 的表達(dá)來促進(jìn)組織駐留。作者之前的研究表明，LN 和皮膚中的記憶 T 細(xì)胞維持具有不同的特性，因?yàn)楹笳咝枰?CD103 表達(dá)，而前者不需要。無論如何，目前的研究不排除 LN 和皮膚compartments之間通過逆行遷移的潛在通信，眾所周知，逆行遷移在病毒感染模型中維持 LN Trm 種群。雖然我們沒有觀察到 LN Trm 細(xì)胞在結(jié)合 30 天后達(dá)到平衡，但在自身免疫過程中可能會(huì)在幾個(gè)月內(nèi)通過淋巴管實(shí)現(xiàn)更漸進(jìn)的平衡。此外，LN Trm 細(xì)胞與 LN 中的小群 CD103-Tcirm 細(xì)胞共存，后者不產(chǎn)生 IFNg，并表現(xiàn)出更類似干細(xì)胞或祖細(xì)胞耗盡的狀態(tài)。更好地了解 LN 和皮膚中這些腫瘤特異性區(qū)室之間的關(guān)系應(yīng)該更好地了解我們對(duì)區(qū)域抗腫瘤免疫的理解。
根據(jù)先前的工作查看目前的研究，腫瘤抗原的性質(zhì)可能是 LN Trm 生成的重要因素。我們之前表明 MAV 是形成針對(duì) LN 中共享黑色素瘤/黑色素細(xì)胞抗原的記憶所必需的。雖然之前的工作沒有根據(jù) Trm 標(biāo)記區(qū)分 LN population，但我們現(xiàn)在認(rèn)識(shí)到這些依賴白斑的population是 Trm 細(xì)胞。相比之下，針對(duì) B16 表達(dá)的 OVA（一種模型腫瘤特異性抗原）的 T 細(xì)胞在 LN 中發(fā)育成常規(guī)的 CD62Lhi 記憶 T 細(xì)胞。黑色素細(xì)胞抗原被 MAV 小鼠 LN 中的 T 細(xì)胞持續(xù)感知，并且可以維持 LN Trm 種群。 LN Trm population可能反過來使自身免疫性白癜風(fēng)持續(xù)存在，盡管這仍有待探索。盡管慢性抗原暴露，CD8⁺ T 細(xì)胞可以抵抗自身免疫的衰竭。人們可能推測(cè)抗原指導(dǎo) Trm 細(xì)胞在 LN 內(nèi)的定位，因?yàn)?pmel Trm 細(xì)胞聚集在 SCS 中，其中抗原由 APC 交叉呈遞。值得注意的是，腫瘤抗原交叉呈遞和早期轉(zhuǎn)移性侵襲都發(fā)生在 SCS 內(nèi)。將需要涉及自發(fā)轉(zhuǎn)移小鼠模型的研究來證明 Trm 細(xì)胞可防止真正轉(zhuǎn)移到 SCS。然而，我們發(fā)現(xiàn) Trm 細(xì)胞駐留在這個(gè)空間表明它們?cè)趹?zhàn)略上定位這樣做。
我們對(duì)初始抗原接觸位點(diǎn)遠(yuǎn)端器官中持久黑色素瘤保護(hù)的鑒定改進(jìn)和擴(kuò)展了腫瘤特異性記憶 T 細(xì)胞反應(yīng)作為組織受限的概念。 與 LN 相比，肺中的腫瘤保護(hù)是由該組織中的 Tcirm 細(xì)胞群介導(dǎo)的。 肺黑色素瘤保護(hù)中對(duì) Tcirm 細(xì)胞的要求可能反映了腫瘤細(xì)胞引入該器官的機(jī)制，這是通過 Tcirm 細(xì)胞更普遍的靜脈途徑發(fā)生的。 由于肺 Trm 細(xì)胞通常占據(jù)氣道，因此它們可能更適合針對(duì)原發(fā)性肺癌的免疫。 聯(lián)體共生與門靜脈注射手術(shù)相結(jié)合的技術(shù)挑戰(zhàn)排除了我們對(duì)肝臟中這種現(xiàn)象的研究，盡管我們可以推測(cè) Tcirm population廣泛介導(dǎo)了針對(duì)黑色素瘤轉(zhuǎn)移到內(nèi)臟器官的免疫。

In conclusion, the present studies reveal the tissue-wide diversity of anti-tumor memory T cells, while highlighting a novel population of protective Trm cells within LNs. This work adds to a growing body of literature supporting a role for Trm cells in cancer immunity while filling a long-standing void in our understanding of tumor rejection within LNs. We propose that the installation of memory T cells across lymphoid and peripheral tissues will be a critical path to achieving curative cancer immunity.

Methods（關(guān)注一些重點(diǎn)方法）

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