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前言

在生發中心（Germinal Center，GC）形成的過程中，濾泡輔助性T（T follicular helper，Tfh)細胞承擔著重要的角色。最初，科學家們基于其特異性高表達CXCR5鑒定Tfh；隨后的研究發現，Tfh細胞還高表達PD-1、ICOS以及BTLA，卻不表達常見于T細胞的標識分子CD62L、CCR7和PSGL1，因而研究者們提出將Tfh與其他輔助性T細胞亞群進行區分的觀點。2009年，Bcl6被確定為Tfh細胞的特異性譜系轉錄因子。然而，Tfh細胞的不同亞群在表型和功能上并不完全一致，雖然已經有研究揭示了其組成的異質性，但仍需進一步深入分析及驗證。

記憶T細胞是免疫應答后的產物，這些細胞在無進一步抗原刺激下依舊可以存活并進行自我更新。基于其表面分子的表達及功能的異質性，記憶T細胞可分為中樞記憶（Tcm）、效應記憶（Tem）以及組織駐留記憶（Trm）T細胞。Tem細胞表達歸巢受體并能分泌多種細胞因子；而Tcm細胞很少分泌效應細胞因子，但高表達CD62L和CCR7；Trm細胞則表達CD103及CD69，并特異性定位于炎癥組織中。近來，通過對慢性感染及腫瘤模型的研究，研究者們已經確定了一種具有干細胞特性的CD8⁺ T細胞亞群，發現其對腫瘤治療中的免疫檢查點阻斷療法異常敏感，從而成為了潛在的免疫治療靶點。然而，對于CD4⁺ T細胞亞群還未得到充分研究，特別是其中的Tfh細胞，對其是否、何時以及如何產生記憶細胞知之甚少。

本研究通過對幾種處理條件下產生的CXCR5⁺Bcl6⁺ Tfh細胞進行了單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析。結果顯示除了已表征的PD-1^hi效應Tfh細胞亞群外，還有一個CD62L⁺PD-1^low亞群，它們獨立于PD-1⁺細胞發育，不與B細胞直接接觸。更重要的是，CD62L⁺ Tfh細胞表達記憶和干細胞相關基因，且具有更好的長期存活率，在再次免疫反應中也更容易產生效應細胞。因此，本項研究揭示了Tfh細胞的異質性，并為記憶Tfh細胞的發育和調節提供了新的見解。

主要內容

一、scRNA-seq分析揭示Tfh細胞的異質性

首先，作者使用10x單細胞測序平臺，基于CD4⁺CD44^hiCXCR5⁺Bcl6-RFP⁺Foxp3-GFP^-B220^-圈門策略，對從KLH免疫的Bcl6^RFP×Foxp3^GFP報告小鼠中分離的活Tfh細胞進行了scRNA-seq測序。對數據進行串聯及質控后，總共捕獲了5410個細胞，每個細胞具有1251個中位基因。通過無監督聚類確定了10個主要的細胞群（圖1A），進一步通過差異表達基因（DEGs）對每個細胞簇進行定義，簇1（C1）高表達經典的Tfh細胞標記基因，包括Pdcd1、Lag3、Hif1a、Tox、Il21、Cxcr5和Tox2，表現出常規效應Tfh細胞的特征。Sell⁺中樞記憶樣（C3）、Ifit1⁺干擾素刺激（C6）、Stmn1⁺高度增殖（C5和C7）Tfh細胞亞群以前未被鑒定。由于特異性譜系轉錄因子的缺乏，未對C0和C2簇進行定義（圖1A）。C8和C9簇可能分別是巨噬細胞和B細胞，也被排除在進一步分析之外。值得注意的是，Pdcd1和Sell在Tfh細胞中的表達是相互排斥的。Pdcd1主要表達于C1、C5和C7簇中，在C3簇中幾乎沒有檢測到，而Sell在C3和C6簇中高度表達。

接下來，作者進一步分析C1（Pdcd1^hi）和C3（Sell^hi）中的DEGs。C1高表達許多以前被表征為在Tfh細胞產生和發揮功能中具有重要地位的基因，因此其可能代表效應Tfh細胞。而C3則高表達與記憶T細胞形成相關、參與細胞定位和遷移、抗凋亡、細胞周期抑制以及與干細胞相關的基因（圖1C）。證實了Bcl6⁺ Tfh細胞可能具有異質性。

為進一步檢測這些細胞的異質性的產生并不僅限于KLH免疫，作者利用相同的圈門策略，從流感感染小鼠的引流淋巴結和na?ve小鼠的派爾斑(Peyer’s Patches, PP)中提取Tfh細胞，并進行scRNA-seq測序。同時通過CD4⁺CXCR5⁺Bcl6-RFP⁺Foxp3-GFP⁺門控策略對從KLH免疫的Bcl6^RFP×Foxp3^GFP報告小鼠中分離的濾泡調節性細胞(Tfr)進行類似研究。UMAP分析揭示，在KLH免疫模型中，Tfh和Tfr的細胞亞群大體保持一致（圖1D）。與KLH免疫模型和流感感染模型相比較，PP模型中的Tfh細胞展現出相對較高豐度的C1以及較低豐度的C3（圖1D）。此外，源于KLH免疫模型的Tfr細胞的C4簇是特異性存在的，在三種模型的Tfh細胞中均未被發現，且高表達與調節性T細胞的發育和功能有關的基因（圖1D）。

為了驗證上述scRNA-seq分析的結果，作者通過流式細胞術分析了KLH免疫小鼠引流淋巴結中CD4⁺CD44^hiCXCR5⁺Bcl6⁺ Tfh細胞表面PD-1和CD62L蛋白的表達情況，發現60%的GC-Tfh細胞表達PD-1，25%的GC-Tfh細胞表達CD62L（圖1E、F），并且在另外兩種模型中觀察到類似的細胞分布模式（圖1E、F）。

二、CD62L+Tfh細胞百分比隨免疫應答進展而增加

上述生物信息學分析揭示了CD62L⁺ Tfh細胞亞群的存在。為了進一步表征這些細胞，作者在不同時間點，對KLH免疫后的B6小鼠中的Tfh細胞進行分析顯示，PD-1⁺ Tfh細胞是免疫反應早期階段的主要細胞群（圖2A-C），而CD62L⁺ Tfh細胞的百分比隨著時間的推移而增加（圖2A-C），表明它們可能代表記憶細胞。作者還使用OT-II TCR轉基因小鼠模型，分析了抗原特異性Tfh細胞。與KLH免疫模型相似，轉移到CD45.1受體小鼠中的na?ve OT-II T細胞在OVA免疫后發育成PD1⁺和CD62L⁺Tfh細胞群（圖2D-F）。不同的是，PD-1+與CD62L⁺ Tfh細胞的百分比在免疫反應早期增加，在免疫反應達到峰值后均降低（圖2F）。另外，可能由于scRNA-seq靈敏度的限制，Tfh細胞中的Bcl6轉錄因子并沒有被很好的檢測到，于是作者對Bcl6進行細胞內染色，發現CD62L⁺ Tfh細胞和PD-1⁺ Tfh細胞中的Bcl6蛋白表達水平是相當的（圖2G、H）。同時，在CD62L⁺ Tfh細胞和PD-1⁺ Tfh細胞之間，Bcl6基因座的總染色質可及性沒有顯著差異（圖2I）。綜上所述，可以將在scRNA-seq中發現的CD62L⁺ Tfh細胞確定為真正的Tfh細胞。

三、CD62+ Tfh細胞不是來源于表達IL-21的PD-1+ Tfh細胞

為了分析CD62L⁺ Tfh細胞是否隨著細胞分裂而發育，作者將來自Bcl6^RFP×Foxp3^GFP×OT-II小鼠中CFSE標記的na?ve OT-II T細胞轉移到CD45.1轉基因小鼠中，并用OVA蛋白進行免疫。結果顯示，在OVA免疫后細胞分裂三次以上可檢測到CD45.2⁺CD44^hiCXCR5⁺Bcl6⁺ Tfh細胞，進而可檢測其表面PD-1和CD62L的表達。可以觀察到Tfh細胞隨著細胞分裂同時獲得PD-1和CD62L表達（圖3A、B），表明CD62L⁺和PD-1⁺ Tfh細胞在免疫反應的早期階段同時產生。作者進一步探索CD62L⁺ Tfh細胞的發育軌跡，這群細胞是否來自PD-1⁺ Tfh細胞。在進一步的分析中，作者使用了一種新的IL21命運映射小鼠。首先，對KLH免疫后的IL21^VFP報告小鼠進行分析，作者證實了PD-1與IL-21在CXCR5⁺細胞中共表達（圖3C、D）。隨后，通過利用新的IL21^creRosa^YFP譜系追蹤小鼠，作者發現在KLH免疫后的免疫收縮期（第21天），記憶CD62L⁺ Tfh細胞不表達IL-21（圖3C、E），表明大多數記憶CD62L⁺ Tfh細胞不是來源于表達IL-21的PD-1⁺ Tfh細胞。同時，作者還觀察到一部分CD62L⁺ Tfh細胞在早期即表達中等水平的IL-21，但在免疫收縮期沒有檢測到這些細胞（圖3C），這表明它們壽命不長，可能不能作為Tfh的記憶前體細胞。另外，通過RNA速率分析，作者觀察到從Sell^hi到Pdcd1^hi Tfh細胞的發育軌跡（圖3F）。

為了更好地表征CD62L⁺ Tfh細胞，作者對KLH免疫后產生的PD-1⁺和CD62L⁺ Tfh細胞進行了TCR克隆型分析，以na?ve T細胞作為對照。結果顯示，na?ve T細胞和Tfh細胞的兩個亞群之間的TCR克隆型是不同的（圖3G）。值得注意的是，CD62L⁺和PD1⁺ Tfh細胞共享許多TCR序列，這表明PD1⁺和CD62L⁺細胞來源于相同的祖細胞（圖3G）。這與OT-II T細胞獲得的結果一致，均提示抗原特異性CD62L⁺和PD-1⁺ Tfh細胞的產生是一個隨機過程。然而，仍然有一部分CD62L⁺ Tfh細胞攜帶獨特的TCR（圖3G），可能是這些CD62L⁺ Tfh細胞來源于預先存在的或旁觀記憶T細胞。隨后，作者進一步分析了PD-1⁺和CD62L⁺ Tfh細胞之間共享的TCR β序列，結果發現某些TCR序列在兩組細胞之間顯示出不同的分布（圖3H、I），這表明TCR信號可能影響PD-1⁺和CD62L⁺ Tfh細胞的發育。

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四、表達CD62L的Tfh細胞不優先與B細胞接觸

Tfh細胞是一類專門協助B細胞分化發育的輔助T細胞，其對B細胞濾泡生發中心反應和高親和力抗體的產生至關重要。因此，作者隨后比較了表達PD-1和CD62L的Tfh細胞與B細胞的結合情況。對來自KLH免疫的Bcl6^RFP×Foxp3^GFP報告小鼠（圖4A）中與B細胞結合的Tfh細胞進行分選，提示大多數B細胞結合的Tfh細胞是PD-1⁺，而幾乎不表達CD62L（圖4 B），表明CD62L⁺ Tfh細胞不優先與B細胞接觸。然而，隨后作者觀察到表達PD-1和CD62L的Tfh細胞都需要B細胞的輔助而產生，因為在KLH免疫的B細胞缺陷型μMT小鼠中PD-1⁺和CD62L⁺ Tfh細胞都不存在。這些結果表明，CD62L⁺ Tfh細胞雖然不優先與B細胞接觸，但其發育依賴于B細胞。為了進一步表征CD62L⁺ Tfh細胞的細胞定位，作者進行了免疫熒光實驗。通過免疫Bcl6-RFP報告小鼠，我們觀察到與CD62^-Bcl6⁺ T細胞相比，GC區域內表達CD62L的Bcl6⁺ T細胞的比例顯著降低（圖4C、D），表明GC中大多數Bcl6⁺的CD4 T細胞很可能表達PD-1，而缺乏CD62L的表達。此外，作者對CD62L⁺BCL6-RFP⁺細胞總體分布的綜合分析闡明了它們主要定位于PNA⁺B220^- GC區域，在PNA^-B220⁺濾泡套和T細胞區僅稀疏存在（圖4E）。

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五、CD62L+Tfh細胞表現出記憶細胞的特征

為了更好地分析CD62L⁺ Tfh細胞的特征，作者基于前述的scRNA-seq結果比較了Pdcd1^hi細胞簇（C1）和Sell^hi細胞簇（C3）的DEGs。結果表明，Sell^hi簇中特異性表達的基因與干細胞和細胞周期有關的途徑相關性高（GO：0019827；GO：0035019），但與參與mTCRC1信號傳導和糖酵解過程的基因相關性較低（圖5A）。基因組富集分析（GSEA）也揭示了CD62L⁺ Tfh細胞在與Wnt、Notch和Hedgehog信號通路相關的基因集上顯著富集，而PD-1⁺Tfh細胞在與細胞周期、凋亡和氧化磷酸化相關的基因集上顯著富集（圖5B）。

接下來作者進一步驗證scRNA-seq的分析結果，作者比較了CD62L+和PD-1⁺ Tfh細胞的bulk RNA-seq數據，與scRNA-seq數據一致，與PD-1⁺ Tfh細胞相比，CD62L⁺ Tfh細胞表現出與抗凋亡和淋巴細胞遷移相關的基因表達增加，與細胞周期和Tfh效應功能相關的基因表達減少（圖5D）。

為了了解PD-1⁺和CD62L⁺ Tfh在表觀遺傳水平上是否不同，作者使用ATAC-seq進行染色質可及性分析。總的來說，CD62L⁺ Tfh細胞的總開放染色質區明顯少于PD-1⁺ Tfh細胞。Pdcd1和Sell基因座分別表現在PD-1⁺和CD62L⁺ Tfh細胞中的可及性增加。對PD-1⁺和CD62L⁺ Tfh細胞中的開放染色質區域進一步分析，發現干細胞相關的基因結合基序與CD62L⁺ Tfh細胞的可及染色質區域密切相關（圖5F）。相反，與T細胞效應功能相關的基因結合基序在PD-1⁺ Tfh細胞中富集（圖5G）。

隨后，作者驗證了CD62L⁺ Tfh細胞的記憶和干細胞樣特征，將來自OVA免疫的CD45.1小鼠的CD62L⁺和PD-1⁺ Tfh細胞過繼轉移至接受了na?ve CD4⁺ T細胞的Bcl6^RFP×Foxp3^GFPOT-II轉基因小鼠（圖6A、B）。在無抗原刺激的情況下，PD-1⁺ Tfh細胞迅速凋亡，CD62L⁺ Tfh細胞則顯示出較低的細胞死亡率（圖6B），并隨后遷移到外周淋巴器官中（圖6C）。重要的是，在抗原再次攻擊時（圖6D），CD62L⁺ Tfh細胞與na?ve Tcells（圖6E）一樣增殖，且增殖迅速。值得注意的是，與所有其他細胞類型相比，CD62L⁺ Tfh細胞可更有效地產生次級CXCR5+Bcl6⁺ Tfh，特別是PD-1⁺效應Tfh細胞（圖6E、F）。作者還觀察到，在接受CD62L⁺ Tfh細胞的小鼠中，GC B細胞反應、產生抗原特異性抗體更強烈（圖6J-L）。這些觀察結果表明，CD62L⁺ Tfh細胞在再次免疫反應中反應更快，并為B細胞提供更有效的幫助。

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六、轉錄因子KLF2調控CD62L+Tfh細胞的發育

scRNA-seq數據顯示，Il7r表達與Sell相關，但與Tfh細胞中Pdcd1表達無關（圖1B）。ATAC-seq分析顯示，Il7r基因座在CD62L⁺比在PD-1⁺ Tfh細胞中更容易接近，表明Il7r是信號傳導、記憶T細胞產生和維持的重要調節因子，且可能有助于CD62L⁺ Tfh細胞的調節。因此，作者給轉移了Bcl6^RFP×Foxp3^GFPOT-II轉基因小鼠na?ve CD4+ T細胞且被OVA免疫的CD45.1受體小鼠施用抗IL7R阻斷抗體。結果顯示在免疫反應的高峰和晚期，IL7R阻斷增加了Tfh細胞中PD-1的表達，降低了CD62L的表達。該數據表明IL7R信號調節了CD62L⁺PD-1⁺ Tfh細胞的發育。

scRNA-seq數據同樣顯示，Klf2的表達被限制在Sell^hi Tfh細胞中（圖1B）。為了進一步理解驗證，作者利用KLF2GFP報告小鼠，發現KLH免疫后Tfh細胞中KLF2與CD62L明顯共表達，但不與PD-1共表達（圖7A、B）。隨后，作者利用Bcl6^creERT2Klf2^flfl×OT-II小鼠，將其在接受他莫昔芬治療后，特異性敲除Bcl6⁺ Tfh細胞中的Klf2。將來自Bcl6^creERT2Klf2^flfl×OTII小鼠的na?ve OT-II細胞轉移到CD45.1受體小鼠中，隨后進行OVA免疫，并在免疫后的第3、5和7天將他莫昔芬或對照劑玉米油，通過腹膜內注射到受體小鼠中（圖7C）。結果顯示總CXCR5⁺Bcl6⁺ Tfh細胞百分比不受Klf2缺陷的影響（圖7D），而PD-1⁺和CD62L⁺ Tfh細胞都發生了顯著改變（圖7E）。在KLF免疫的Bcl6^creERT2Klf2^flfl小鼠中也觀察到類似的結果（圖7F-H），Tfh細胞中Klf2的缺乏抑制了CD62L⁺ Tfh的發育，但不影響總的Tfh細胞群（圖7G、H）。此外，作者觀察到Klf2調節CD62L⁺ Tfh細胞的功能是劑量依賴性的，因為其在Bcl6^creERT2Klf2^fl/+小鼠中發揮最小的作用（圖7H）。

此外，作者將來自Bcl6^creERT2Klf2^flflOT2轉基因小鼠的na?ve OT-II細胞轉移到Tcrbd^-/-受體小鼠中，隨后進行OVA免疫和他莫昔芬誘導的Klf2缺失處理（圖7I）。在初次免疫后第21天進行OVA/IFA再免疫。結果顯示在他莫昔芬處理的小鼠中，CXCR5⁺Bcl6⁺ Tfh細胞比對照小鼠顯著減少（圖7J、K），特別是PD-1^hi效應Tfh細胞（圖7M）。還觀察到Tfh細胞中Klf2的缺失導致二次免疫反應期間無功能PD-1^-CD62L^- Tfh細胞的積累（圖7M），同時，GC B細胞反應降低、抗原特異性IgG產生也顯著減少（圖7L、N）。這些結果表明，表達Bcl6⁺Tfh細胞中Klf2的缺失抑制了記憶Tfh細胞的形成。

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小結

本篇文章的故事線：Tfh細胞在GC反應的調節過程中占據了重要地位。然而，Tfh細胞的不同亞群在表型和功能上并不完全一致。因此，本篇文章旨在揭示Tfh細胞的異質性，并為研究記憶Tfh細胞的發育和功能調節提供新的理論支持。

作者首先對在幾種處理條件下產生的CXCR5⁺Bcl6⁺Tfh細胞進行了scRNA-seq，同時結合流式細胞術進行分析，結果顯示除了已表征的PD-1^hi效應Tfh細胞亞群外，還存在一個CD62L⁺PD-1^low亞群。隨后通過利用不同的小鼠模型，觀察到CD62L⁺Tfh細胞百分比隨免疫應答進展而增加；在作者構建的發育軌跡中，CD62⁺ Tfh細胞不是來源于表達IL-21的PD-1⁺ Tfh，且它們不優先與B細胞接觸。基因富集分析及ATAC-seq分析顯示CD62L⁺ Tfh細胞對細胞凋亡具有相對抗性，并且具有干細胞樣表型，還可以有效地產生效應細胞來響應二次免疫反應。

最后，聚焦于轉錄因子對CD62L⁺ Tfh細胞的發育調控，在scRNA-seq分析的基礎上，建立klf2缺陷的小鼠模型，證實了在CD62L⁺ Tfh細胞中特異性表達的Klf2是這些細胞產生發育過程中所必需的。

研究觀點：此項研究基于對三種不同處理條件下產生的CXCR5⁺Bcl6⁺ Tfh細胞進行了scRNA-seq分析，揭示了CD62L⁺亞群的存在。隨后，研究整體建立在逐步深入的生信數據分析結果之上，并開展相關動物實驗進行驗證。一方面為記憶Tfh細胞的發育及調控進行了驗證，另一方面通過結合bulk RNA-seq、ATAC-seq分析，觀察到CD62L⁺ Tfh細胞表達記憶和干細胞相關基因，且在再次免疫反應中也更容易產生效應細胞。總的來說，文章從CD62L⁺亞群的發生、發育及功能各個方面講述了一個比較完整的故事。