工作已經進入了正軌，10X單細胞空間似乎永遠在路上，但是慢慢研究的風向開始起了變化，單細胞空間都不再滿足于對組織的研究，而是要靠向臨床，運用單細胞空間技術對臨床進行指導，今天分享的文獻在Tumor and immune reprogramming during immunotherapy in advanced renal cell carcinoma，發表于Cancer Cell,IF32分，單細胞的研究開始結合臨床數據等等，看起來，每個技術不能停留在實驗室，而是要走向應用。
總結一下小知識
TOX 和 ENTPD1（編碼 CD39）是兩種在腫瘤特異性 T 細胞中上調的耗竭標志物
單核細胞，目前最新的研究結果認為，單核細胞有兩種分化途徑，分別是CMP→粒細胞-單核細胞前體（Granulocyte-monocyte progenitor，GMP）→單核細胞，以及CMP→單核-樹突狀細胞前體（Monocyte-Dendritic cell progenitor，MDP）→單核細胞。單核細胞可以繼續分化為部分組織中的巨噬細胞，例如腸道和真皮等。但最新的研究顯示，大多數組織如大腦（microglial cell，小膠質細胞）、表皮（langerhans cell，朗格漢斯細胞）、肝臟（kuffer cell，枯氏細胞）和肺泡中的巨噬細胞并非依靠后期的單核細胞分化更新，而是由胚胎造血系統直接原位分化，在胚胎發育階段就已經定植到組織中，并且在組織中自我更新和維持。單核細胞能吞噬異物并進行抗原遞呈，可以被看作不成熟的巨噬細胞，因此有些研究者直接將單核細胞稱為巨噬細胞，或者將單核細胞和巨噬細胞統一稱為Monocytes/Macrophage類群。根據細胞表面的一組蛋白質，單核細胞可以分為三類：經典（Classical）、非經典（Non-classical）和中間型（Intermediate），它們在免疫系統中起著不同的作用。典型單核細胞占單核細胞的80%~90%，具有更高水平的吞噬和抗菌活性，并且表現出較高的過氧化物酶活性，在產生活性氧（ROS）方面更有效。它們還具有更高水平的趨化因子受體，能夠遷移到損傷和炎癥部位；非經典單核細胞的功能偏向于調節和監視，這些細胞吞噬作用、ROS和促炎因子的水平較低，主要在傷口或感染部位招募其他細胞，促進傷口愈合并應對病毒感染等，也有一些研究表明，非經典單核細胞同樣直接參與免疫調節；中間型單核細胞，其功能處于中間狀態，具有炎癥特性，但同時具有較低的過氧化物酶活性。
一般來說，單核細胞的固有標志物是CD14，人可以用CD16來區分不同亞型：經典型單核細胞標記為CD14+CD16-；中間型單核細胞標記為CD14+CD16+；非經典型單核細胞標記為CD14+CD16++。小鼠可以用Ly6C來區分，經典單核標記為CD14+Ly6C++；中間型為CD14+Ly6C+；非經典為CD14+Ly6C low。同時，還可以利用炎癥因子和趨化因子受體來進行區分，包括CCR5、CX3CR1、CD62L等。此外，由于巨噬細胞同樣表達這些marker，如果要區分單核細胞和巨噬細胞，則需要添加巨噬細胞的標志物，例如人的CD80、小鼠的F4/80等。
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巨噬細胞作為固有免疫中的重要細胞組分，能對入侵病原體做出反應，吞噬和消化病原體，也可以參與清除受損、衰老的細胞，通過抗原提呈參與激發適應性免疫。但是巨噬細胞除了在對抗疾病中發揮作用外，也與慢性疾病（包括動脈粥樣硬化、哮喘、炎癥性腸病、關節炎等）、自身免疫性疾病（包括類風濕性關節炎、多發性硬化癥）、糖尿病、腫瘤的發生發展相關。巨噬細胞根據其所處部位，可以將巨噬細胞分為小膠質細胞、肝臟Kupffer細胞、肺泡巨噬細胞、腎臟系膜細胞、破骨細胞、脾臟紅髓巨噬細胞、脂肪組織相關巨噬細胞等。它們除了執行吞噬和免疫防疫功能外，也參與組織重塑和維持組織穩態。此外，它們可能在不同的組織中執行特定的功能，例如小膠質細胞在腦組織中發揮免疫監視、清除死亡神經元、突觸重塑的功能，破骨細胞從骨基質中吸收有機物和礦物質，脾臟中的紅髓巨噬細胞能清除衰老的紅細胞、調節鐵代謝等。各部位的特征marker詳見表1。
圖片.png 相較于按組織進行分類，研究者們更喜歡把巨噬細胞按特征和功能進行區分。根據活化狀態、功能及分泌細胞因子的不同，巨噬細胞主要可分為經典活化的M1型巨噬細胞（促炎）和選擇性活化的M2 型巨噬細胞（抗炎）。
- M1型巨噬細胞可以由IFN-γ、LPS或GM-CSF誘導，高表達MHC II類分子和共刺激分子CD80、CD86，上調表達誘導型一氧化氮合酶（iNOS），產生大量的促炎細胞因子，如IL-1、IL-6、IL-12、IL-23、TNF-α，同時會產生趨化因子CCL2、CCL3、CCL5、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL16，一氧化氮（NO）和活性氧物質（ROS）。通過釋放這些炎性介質，M1細胞可以促進炎癥反應，殺傷胞內感染的病原體，抗腫瘤。
- M2型巨噬細胞由IL-4、IL-13、真菌和寄生蟲感染、免疫復合物、IL-10、TGF-β、糖皮質激素等誘導，高表達CD163、CD206、CD200R、CD209、CD301、Arginase-1，產生抗炎細胞因子如IL-10、TGF-β，參與免疫調節、組織重構和再生、傷口愈合、血管生成、促進腫瘤進展。M2型巨噬細胞可進一步細分為M2a、M2b、M2c、M2d四種亞型。M2a由IL-4、IL-13或真菌和寄生蟲感染誘導，M2b由免疫復合物和LPS誘導，M2c由IL-10、TGF-β、糖皮質激素誘導，M2d可由IL-6和腺苷誘導。
- 除了M1和M2以外，腫瘤相關巨噬細胞（TAM）也是非常常見的研究類型。但是嚴格來說，TAM并非巨噬細胞中的一個子類，而是與特定病理情況相關的巨噬細胞的集合。依據不同的病理狀態，其活化狀態和功能兼具M1和M2的特征。
- 除了上述幾種子類之外，巨噬細胞還有 CD169+和 TCR+兩種類型。CD169+巨噬細胞具有結合紅細胞的能力。淋巴結包膜下竇和髓質區、脾邊緣區中的巨噬細胞高表達CD169。到目前為止，CD169+巨噬細胞的信號傳導途徑和活化信息還不足，與M1、M2的對比也不甚清楚。TCR＋巨噬細胞會表達TCRγδ可變鏈，在細菌暴露后，會表達不同的TCRVδ庫，表明這類細胞能針對不同細菌發生不同的適應性改變，且不僅僅是巨噬細胞，嗜酸性和嗜中性粒細胞同樣被發現部分表達TCRαβ或TCRγδ可變鏈。
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為研究巨噬細胞，通常需要采用一些表型標記物來區分巨噬細胞和其他免疫細胞。小鼠巨噬細胞表達CD11b，F4/80，CSF-1R/CD115；人巨噬細胞表達CD68，CD11b，CD14，CD16，CD163，CD312，CSF-1R/CD115。一般來說，F4/80+ CD11c+ iNOS+定義為M1，F4/80+ CD206+定義為M2。但是巨噬細胞依然有待尋找更好的標志物，目前部分常見的標志物詳見表2.
圖片.png 巨噬細胞M1 associated genes（LI2B、TNF、CXCL9、CXCL10、CXCL11、FCGR1A、IRF1、HLA-DPB1、CD86、MARCO、IL2RA），M2 associated genes（CXCR4、IL27RA、CSF1R、CCL2、CCL7、CCL17、CCL18、CCL23、CTSD、FN1、GAS7、HMOX1、PPARG、LIPA、CD209、CLEC7A、F13A1、MAF、MS4A4A）.
In Brief
剖析免疫檢查點阻斷暴露的轉移性腎細胞癌中的癌細胞和免疫微環境轉錄程序，揭示臨床耐藥背景下免疫亞群重編程和與不同癌細胞群的相互作用。
Highlights（創新點）
- Distinct CD8+ T cell phenotypes are enriched after immune checkpoint blockade (ICB)
- Immune checkpoint ligands are upregulated in macrophages and tumor cells after ICB（都是要結合臨床）
- Two cancer cell subpopulations are conserved across heterogeneous RCC tumors（腫瘤的保守型）
- Cancer cell programs drive distinct immune interactions and predict patient outcomes（癌細胞在驅動不同的免疫相互作用）
SUMMARY
免疫檢查點阻斷 (ICB) 導致部分晚期腎細胞癌 (RCC) 患者的疾病得到持久控制，但驅動耐藥的機制卻知之甚少。在 ICB 治療之前或之后描述了來自轉移性 RCC 患者的癌癥和免疫細胞的單細胞轉錄組。在響應細胞中，細胞毒性 T 細胞亞群表達更高水平的共抑制受體和效應分子。來自處理過的活組織檢查的巨噬細胞響應富含干擾素的微環境而轉變為促炎狀態，但也會上調免疫抑制標志物。在癌細胞中，確定了 ICB 后在血管生成信號傳導和免疫抑制程序上調方面不同的兩個亞群。癌細胞亞群和免疫逃避的表達特征與 PBRM1 突變和原發性和 ICB 治療的晚期 RCC 中的存活相關。研究結果表明，ICB 重塑了 RCC 微環境并改變了癌癥和免疫細胞群之間的相互作用，這對于理解對 ICB 的反應和抗性至關重要。
INTRODUCTION
腫瘤微環境在腎細胞癌 (RCC) 的發生、病理生理學和治療中起關鍵作用（各種癌癥中都一樣的）。 最常見的 RCC 組織學亞型，clear cell RCC (ccRCC)，在 VHL 所在的染色體 3p 缺失的背景下，經常在 VHL 中具有特征性的第二次打擊功能喪失突變。 這些事件導致缺氧誘導因子 (HIF) 的降解減少，導致突變細胞轉向使用糖酵解和分泌 VEGF，從而促進血管生成。 此外，ccRCC 腫瘤被免疫細胞高度浸潤，特別是被 T 細胞浸潤。 利用微環境的這些特征，治療在過去十年中取得了顯著進展，現在廣泛使用 VEGF 酪氨酸激酶抑制劑 (TKI)、免疫檢查點阻斷 (ICB) 以及這些方法的組合。
ICB can provide durable benefit in responders,但大多數患者都會出現耐藥性，并且對癌癥和免疫細胞過程的因果關系知之甚少。 ICB 反應的基因組特征集中在bulk測序的預處理樣本上，其中較低的基線骨髓炎癥和 PBRM1 功能喪失與某些患者群體的反應有關。 對腫瘤內和腫瘤間異質性的觀察使機制理解復雜化，ccRCC 的多種分子亞型由一組染色質重塑劑中的突變定義，這些突變表現出不同的進化和轉移模式.
bulk測序不太適合研究細胞類型特異性對治療的反應模式。 缺乏具有代表性的臨床前免疫活性 RCC 模型對研究細胞類型之間的相互作用和信號傳導提出了進一步的挑戰。 為了應對這些挑戰，最近的研究利用患者樣本的單細胞分析來查明起源癌細胞并描述未經治療的 RCC 中的免疫細胞。 因此，假設，在 ICB 治療之前或之后對活檢組織進行單細胞轉錄組解剖將揭示免疫和癌細胞計劃，這些計劃決定了治療反應并指定了對抗耐藥性的目標。
RESULTS
Characterizing the tumor microenvironment of advanced RCC during therapy
這里收集了 8 名患者的新鮮活檢或手術切除樣本，其中 7 名患有轉移性腎細胞癌，1 名患有局部疾病。使用 10 X 平臺對解離的細胞進行單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq)，并在可用的情況下使用額外的組織進行bulk全外顯子組測序。活檢時，5 名患者接觸過 ICB（包括 4 名同時接觸 TKI 和 ICB），3 名患者未接受全身治療。在腎切除術的情況下，標本來自腎臟，否則來自淋巴結和內臟轉移。七名患者患有 ccRCC，而一名腫瘤具有 2 型乳頭狀 RCC 組織學，具有 PBRM1 和 SETD2 突變。正如預期的那樣，在可獲得基因組特征的 ccRCC 患者中普遍檢測到染色體 3p 丟失，在 VHL 和/或編碼染色質重塑物的基因中存在額外的二次突變。概括地說，隊列在基因組和臨床特征方面概括了晚期 ccRCC 的典型特征。
經過QC后，數據集包括 34,326 個總細胞，涵蓋各種癌癥和非惡性細胞類型。 為了減輕可能的批次效應并允許對具有患者特異性表達模式的癌細胞進行聯合分析，使用 Seurat 基于 CCA 的比對來聚合樣本中的細胞，并以無監督的方式將它們聯合聚類。基于標記基因標記聚類表達，識別在患者、活檢部位和接受的全身治療之間共享的癌癥和非癌細胞clusters。
CD8+ T cell remodeling by ICB
隊列中所有exposed于 ICB 的患者都接受了針對 PD-1 axis的治療，因此假設治療可能會導致淋巴compartment的細胞（亞）類型特異性重塑。 為了解決這個問題，首先在廣泛的淋巴細胞類型中進行無監督聚類，以識別患者、活檢部位和治療歷史中保守的細胞狀態。 鑒定了 12 個淋巴細胞亞群，包括 B 細胞、漿細胞、自然殺傷 T 細胞、FGFBP2+ 和 FGFBP2- 自然殺傷細胞、調節性 T 細胞以及記憶和效應 T 輔助細胞。
CD8+ T 細胞形成了四個不同的細胞群，包括一個在細胞周期中progressing的細胞群、一個以干擾素刺激基因 MX1 表達為標志的小細胞群，以及兩個通過表達包括 TNFRSF9（encoding the activation marker 4-1BB） 在內的一組基因而分化的細胞群。 共抑制受體 PDCD1（編碼 PD-1）、HAVCR2（編碼 TIM-3）和 LAG3 在所有 CD8+ T 細胞亞群中表達，但在更大比例的 4-1BB-Hi 細胞中檢測到。 TOX 和 ENTPD1（編碼 CD39）是兩種在腫瘤特異性 T 細胞中上調的耗竭標志物，在 4-1BB-Hi 和循環細胞中也升高。 在與 ENTPD1 相反的模式中，觀察到 IL7R 和 STAT4 在細胞亞群中的表達，這兩個基因與 T 細胞壽命和記憶相關，在與黑色素瘤中 ICB 反應相關的細胞群中上調。
對黑色素瘤模型的研究表明，腫瘤浸潤性 CD8+ T 細胞包括一個祖細胞耗盡的population，該population長期存在，對抗 PD-1 治療有反應，并最終分化為最終耗盡的細胞。 這種 CD8+ T 細胞群在治療前活檢中的頻率預測了用 ICB 治療的黑色素瘤的積極臨床結果。 為了確定在 RCC 中恢復的任何 CD8+ T 細胞亞群是否類似于這種祖細胞耗盡的表型，對單個細胞的祖細胞和最終耗盡的基因特征進行了評分。 發現祖細胞耗盡的特征在 4-1BB-Lo clusters內的一個細胞子集中富集。 相反，在其他 CD8+ T 細胞群中，terminally exhausted的特征升高。
確定了 RCC 中的候選 CD8+ T 細胞亞群與之前描述的祖細胞衰竭群體有一些相似之處，接下來檢查了基于 ICB exposure的表達差異。在 CD8+ T 細胞亞群中，發現 PDCD1、TIGIT 和 HAVCR2 在 ICB exposure的活檢中僅在 4-1BB-Lo cluster內顯著上調，這是由響應驅動的效應。在效應分子中，觀察到 4-1BB-Lo 和 4-1BB-Hi population中 GZMB、PRF1 和 IFNG 的 ICB exposure活檢組織中表達升高，但只有 4-1BB-Lo 細胞上調 GZMA 和 FASLG。同樣，只有 4-1BB-Lo 細胞上調了許多共刺激分子和趨化因子。相反，來自 ICB exposure活組織檢查的 4-1BB-Lo 細胞下調了與祖細胞衰竭表型相關的幾個基因，暗示可能向更終末期衰竭狀態分化。在黑色素瘤模型中，多功能祖細胞耗盡的 CD8+ T 細胞在響應抗 PD1 期間分化為更終末耗盡的表型，而后者population主要負責腫瘤殺傷，盡管壽命很短。在隊列中接觸 ICB 的患者的 4-1BB-Lo 細胞中，觀察到與來自無反應者的細胞相比，來自反應者的細胞中最終耗盡的基因特征顯著富集。
為了驗證在未配對活檢中觀察到的這些現象，檢查了接受抗 PD-1 抗體 nivolumab 單藥治療的更大隊列患者 (Checkmate 009)，這些患者可以使用Longitudinal治療前和治療中bulk轉錄組。在這些配對活檢中，觀察到治療樣本中表達特征的水平顯著增加，該表達特征源自比較來自我們單細胞隊列的 ICB exposure與 ICB 幼稚 4-1BB-Lo 細胞。一致地，治療樣本表現出更高水平的共抑制（例如，PDCD1、LAG3）和效應分子（例如，IFNG、PRF1）。這些發現與 RCC 中可能存在的 4-1BB-Lo CD8+ T 細胞亞群一致，但并未明確證實，這些細胞亞群對抗 PD1 治療的反應機制類似于在基于黑色素瘤和慢性病毒感染。Longitudinal單細胞研究對于明確檢測個體患者中亞群特異性治療相關分化是必要的。
Shift toward inflammation in tumor-associated macrophages
除了適應性免疫外，先天免疫系統在腫瘤存活和治療抵抗中起著關鍵作用。 特別是，據報道，腫瘤相關巨噬細胞 (TAM) 在腫瘤微環境中發揮著多種相反的作用，其不同的表型促進炎癥、腫瘤生長、血管生成和轉移以及癌細胞殺傷。 在 ccRCC 中，TAM 是多種多樣的，mass cytometry with worse識別出 17 種表型和高骨髓炎癥，這與抗 PD-1 治療的較差結果相關。 因此，試圖描述隊列中的骨髓細胞及其對治療的反應。
這里提取了基于標記表達從完整數據集中識別出的骨髓細胞，并對它們進行亞聚類，識別出兩個樹突細胞clusters（CLEC9A+ 和 CD1c+ 經典樹突細胞）、兩個單核細胞clusters（經典 CD16- 和 CD16+ 單核細胞）和五個clusters TAMs 表達了多種免疫調節基因。這些細胞群的比例在患者之間和整個 ICB exposure狀態下是穩定的。將巨噬細胞簡單的 M1/M2 二分法分別分為促進炎癥和傷口愈合/組織修復的表型，越來越多地被理解為不能完美地捕捉 TAM 表型的多樣性，事實上，這里沒有觀察到 M1 和 M2 表達的干凈二分發標記基因。一小部分 CXCL10-Hi TAM 特異性地表達了一組與經典 M1 激活表型相關的基因。然而，其他三個非循環 TAM ulations exp在不同程度上表達了不同的 M2 相關基因。在高表達 GPNMB 的 TAM populations中強有力地檢測到了多個 M2 相關基因，此前有報道稱其在急性腎損傷小鼠模型中促進 M2 極化。一個單獨的 TAM 群具有 FOLR2 表達升高，典型地描述為標記 M2 巨噬細胞，expressed a distinct subset of M2-associated genes。最后一組 M1 和 M2 相關基因混合表達的 TAM 以 VSIR 的高表達為標志，VSIR 編碼 VISTA，一種 PD-1 同源物，作為抑制 T 細胞活化的陰性檢查點。
為了更好地了解這些不同的 TAM populations在 ICB 過程中所起的作用，分析檢查了它們的免疫檢查點基因和免疫相關轉錄程序的表達。 PD-L2 和（在較小程度上）PD-L1（兩者都是 PD-1 信號傳導介導 T 細胞免疫檢查點的配體）在 TAM populations中很少檢測到。 LGALS9、VSIG4 和 VSIR（其蛋白質產物通過其他途徑促進 T 細胞免疫檢查點）以及可抑制巨噬細胞炎癥反應的 SIGLEC10 被更廣泛地檢測到。比較 ICB-exposed 患者有無反應，注意到表達模式發生了廣泛而顯著的變化，表明在所有 TAM 和單核細胞populations中響應干擾素信號轉為 M1 樣表型，CXCL10-Hi TAM 除外，它已經顯示出 M1 極化的證據。同時，觀察到與巨噬細胞活性相關的表達特征的系統性增加，包括抗原呈遞和蛋白酶體功能。總的來說，這些模式表明 ICB 應答者的 TAM 廣泛轉變為促炎表型，這可能是由 CD8+ T 細胞產生的干擾素-g 誘導的。同時，還觀察到 ICB-exposed 與幼稚 TAM 中 CD8+ T 細胞免疫檢查點和巨噬細胞抗炎信號基因的系統性和顯著上調。這種影響大部分是由來自 ICB 反應患者的 TAM 驅動的，與來自無反應者的細胞（所有 ICB 后評估）相比，其 VSIR、VSIG4、PD-L2 和 SIGLEC10 的表達水平進一步增加。因此，即使應答者中的 TAM 表現出更多的促炎表型，它們也表現出可能抑制炎癥免疫微環境的表達變化，從而可能促進最終對 ICB 的抵抗。
Two distinct cancer cell subpopulations
為了更好地了解癌細胞中活躍的可能驅動與免疫系統相互作用的細胞程序，接下來試圖確定癌細胞之間的共享表達模式。 通過基因表達和拷貝數改變將細胞分類為惡性細胞。 將來自不同活檢的癌細胞組對齊，以關注整個隊列中細胞程序的共享變異。 在活檢中，細胞形成了兩個主要clusters，分別稱為腫瘤程序 1 (TP1) 和腫瘤程序 2 (TP2)，少數細胞以細胞周期進展為特征。 TP1 和 TP2 細胞均從所有樣本中回收，除了一個癌細胞很少 (P912) 的樣本，與活檢部位或ICB exposure無關。
對來自兩個主要cluster的細胞的各種基因特征的活性進行了評分，以識別它們轉錄差異背后的細胞程序。在不同的轉移部位，TP1 細胞在腎臟形態發生、粘附連接組裝和血管生成的基因組中得分較高。 TP2 細胞的特征在于代謝程序的巨大差異，糖酵解和氧化磷酸化增加，同時脂肪酸代謝增加。 TP2 細胞中氧化磷酸化和糖酵解基因的同時上調是出乎意料的，表明該腫瘤亞群的代謝升高，這可能表明代謝可塑性允許隨機性的使用不同的能量途徑。這種混合代謝狀態下細胞的存在與預測高 HIF-1 活性下這種細胞狀態的理論模型一致，這在 RCC 中得到了很好的證實，在細胞系中的觀察將這種可塑性與轉移聯系起來。
接下來在 ICB 治療的背景下檢查了這些癌細胞程序對免疫細胞的潛在影響。比較 ICB 反應者和無反應者，癌細胞群都上調了與干擾素-g 反應和主要組織相容性復合物 (MHC) I 類抗原加工相關的基因，表明反應者對促炎癥微環境有反應。然而，ICB 處理的癌細胞也上調了幾個 T 細胞檢查點分子，在兩個群體中具有不同的模式。 TP1 細胞在治療后強烈上調 nectin-2，而 TP2 細胞在幾個檢查點分子的表達中具有更溫和的增加。比較 ICB 反應者和無反應者，TP2 細胞表現出更顯著的差異，廣泛上調大量 T 細胞檢查點分子和參與減少巨噬細胞炎癥和逃避吞噬作用的分子。在隊列的一個更同質的子集中概括了分析的發現。總之，結果表明微環境中許多細胞群之間存在復雜的相互作用，兩種癌細胞群在 ICB 治療期間向 CD8+ T 細胞和 TAM 呈現不同的免疫抑制信號。
TP1 cancer expression program associated with improved survival
TP1 和 TP2 癌細胞在腎臟分化、代謝和免疫抑制信號傳導方面的差異促使我們在一個大型前瞻性隊列中研究它們是否在疾病進展和治療抵抗中發揮不同的作用。分析生成了描述 TP1 和 TP2 的基因特征，并將這些特征限制在癌細胞特異性基因上。利用scRNA-seq 數據生成癌細胞特異性特征后，在一項比較 mTOR 抑制劑依維莫司和 nivolumab 的隨機臨床試驗 (Checkmate 025) 中對來自晚期 ccRCC 的預處理樣本的bulk RNA-seq 進行評分。在多變量分析中觀察到治療前 TP1 評分與僅在接受 nivolumab 的患者中顯著改善的總體生存率之間存在關聯，盡管放射學反應類別之間的評分水平沒有顯著差異。在一項包括來自雙臂建模治療組、TP1 評分和治療-TP1 交互項的患者的聯合分析中，觀察到 TP1 評分與納武單抗治療之間存在顯著的交互作用（p = 0.04，Cox 比例風險）。這些結果表明，TP1 評分與生存率之間的關系是由癌癥-免疫相互作用驅動的。 TP2評分與生存率之間沒有顯著相關性。然而，在接受 nivolumab 治療的患者中，存活率下降與一組免疫檢查點和逃避基因的高表達有關，幾乎所有這些基因在 ICB 反應者與非反應者的 TP2 細胞中均顯著上調，盡管這些基因不是癌細胞特異性（pCox = 0.017）。
為了更好地了解這兩個癌細胞程序的病因，評估了它們是否與潛在的基因組特征相關。 在 Checkmate 025 隊列中，注意到 PBRM1 和 KDM5C 突變腫瘤的 TP1 評分增加，而具有 9p21.3 缺失的腫瘤的 TP2 評分增加，這些缺失與 ICB 抗性相關。 TP1 評分與 PBRM1 突變和 TP2 評分與 9p21.3 缺失的關聯在 TCGA KIRC 隊列中得到證實。 在 ICB 治療的 Checkmate 025 患者中，當將 PBRM1 突變狀態作為協變量時，TP1 評分仍然與增加的生存率顯著相關。 結合觀察與 KDM5C 和拷貝數改變的關聯，這表明 TP1 捕獲了與單基因突變以外的基因組改變相關的轉錄模式。
Checkmate 025 ICB 手臂的生存益處促使進一步研究癌細胞亞群和免疫細胞之間的相互作用。使用源自我們數據集的細胞類型表達特征檢查了在 Checkmate 025（納武單抗組）中推斷的 CIBERSORTx 免疫細胞群豐度。在 TP1 評分較高的腫瘤中，觀察到 4-1BB-Lo CD8+ T 細胞的推斷豐度增加，早期指出 ICB 治療期間效應分子表達的顯著上調以及與促進黑色素瘤中 ICB 反應的祖細胞耗盡細胞的相似性。盡管對大量隊列中相關免疫細胞群豐度的計算推斷具有挑戰性，但這些發現支持癌細胞中 TP1 表達程序與癌癥-免疫細胞相互作用介導的存活之間的關系。總的來說，對具有不同免疫細胞相互作用的不同腫瘤亞群的觀察可能有助于解釋在大量 RNA-seq 中觀察到的不同 RCC clusters，包括異質浸潤的高血管生成腫瘤和非浸潤的高代謝腫瘤。
Cell-cell interactions within the tumor microenvironment
鑒于在 ICB-exposed的 4-1BB-Lo CD8+ T 細胞中觀察到 IFNG 上調、來自 ICB 應答者的 TAM 中的免疫檢查點和逃避基因上調，以及不同的免疫調節癌細胞程序，我們假設不同的細胞群參與復雜的串擾.為了識別可能的非細胞自主效應，我們使用 CellPhoneDB 通過已知的受體-配體對識別不同細胞群之間的推定信號傳導。兩種癌細胞群都被推斷為通過骨橋蛋白（由 SPP1 編碼）向表達 CD44 的 CD8+ T 細胞發出信號，骨橋蛋白是一種抑制小鼠模型中 T 細胞活化的相互作用。同樣，兩種癌細胞群都表達 MIF 和 CD47，向 TAM 上表達的 CD74 和 SIRPa 發出信號，分別促進 TAM 生長因子分泌和抑制吞噬作用的相互作用。然而，只有 TP2 細胞被推斷為通過 galectin-9（由 LGALS9 編碼）與 CD8+ T 細胞和 TAM 上表達的 TIM-3（由 HAVCR2 編碼）結合。通過 TIM-3 發出的信號抑制 CD8+ 細胞毒性細胞活性，并在其他人類癌癥中誘導 TAM 分泌生長因子。此外，TP2 細胞表達 nectin-2，它與 CD8+ T 細胞共抑制受體 TIGIT 結合。盡管這種計算機方法不能明確地建立相互作用，但它表明癌細胞對 T 細胞和 TAM 進行復雜調節的可能性。
還觀察到 CD8+ T 細胞和 TAM 之間相互作用的證據。與來自 ICB 應答者與無應答者的 TAM 中干擾素應答基因的上調一致，CellPhoneDB 推斷出由 CD8+ T 細胞產生的干擾素-g 對 TAM 的調節。在 Checkmate 009 的 ICB 活組織檢查中，標準化的 IFNG 水平與 CIBERSORTx 估計的 CXCL10-Hi TAM 分數以及來自我們單細胞隊列中的 ICB 暴露與 ICB 幼稚 TAM 比較的表達特征密切相關。在相同的樣本中，觀察到在具有較高標準化 IFNG 表達的樣本中，免疫檢查點和逃避基因的表達同時增加，這與其他癌癥類型中報告的免疫抑制負反饋回路一致。事實上，比較同一患者的 ICB 前和 ICB 上活檢，觀察到免疫檢查點和逃避特征以及成員基因（包括 VSIG4、PD-L2 和 SIGLEC10）的表達水平增加。其中一些基因由癌細胞和 TAM 表達，它們的起源無法在bulk轉錄組中破譯，但這些比較表明，腫瘤微環境可能通過增加免疫抑制基因表達來適應 ICB 治療。
DISCUSSION
為了研究免疫系統和癌癥對治療的反應，在 ICB 之前或之后檢查了晚期 RCC 的單細胞轉錄組。 CD8+ T 細胞亞群在應答者中被強烈激活并分化為最終耗盡的表型。這些細胞與在黑色素瘤中被描述為介導 ICB 反應的細胞具有相似性，并且可能對應于被描述為 RCC 中干細胞樣 CD8+ T 細胞后代的群體。在 TAM 中，發現了一小部分促炎人群和多個其他人群，這些人群在 ICB 應答者中響應干擾素-g 信號傳導而一致地轉向促炎表型。 ICB-exposed與 T 細胞檢查點分子表達和抗炎信號的增加有關，這表明免疫系統適應可能是治療抵抗的基礎。在癌細胞中，發現了兩個通過促血管生成、腎臟分化和代謝程序的表達而分化的群體。作為對 ICB 的反應，代謝可塑性和分化程度較低的 TP2 癌細胞上調了許多免疫抑制基因。雖然在隊列中通過活檢觀察到來自兩個群體的細胞，但 TP1 癌癥計劃的增加與 ICB 的存活率增加有關，這表明癌癥-免疫串擾的差異在兩個群體之間起作用。
鑒于適度的活檢數量，臨床異質性對研究構成挑戰。幾乎所有接觸過 ICB 的患者都接觸過 TKI，因此觀察到的效果可能是由聯合用藥驅動的。盡管如此，由于 TKI 和 ICB 聯合治療或序貫治療是標準治療，研究結果仍然與未來的工作相關。 RCC 最常表現為 ccRCC，我們的數據集反映了這一點。盡管我們已經明確關注在患者中發現的表達程序，但需要對其他組織學進行詳細研究。我們在統一處理的bulk 測序臨床試驗隊列中驗證了我們的發現，其中包括縱向 ICB 前后活檢。盡管如此，bulk RNA-seq 受到未知細胞類型混合物的限制，因此未來的工作應集中在使用單細胞方法的大量配對 ICB 初治和 ICB 抗性活檢上。多重成像分析可以闡明在 RCC 中普遍存在的串擾機制。考慮到 TAM 和癌細胞中免疫抑制基因的上調，這尤其緊迫，這可能最終導致耐藥性。
Our findings highlight the importance of studying immunomodulatory pathways away from the PD-1 axis, including T cell inhibition by VISTA expressed by both TAMs and cancer cells。Targeting the CD47/SIRPa axis with anti-CD47 antibodies, perhaps in conjunction with anti-PD-1 therapy, may promote macrophage phagocytosis of TP2 cells, which upregulate a broad range of immunosuppressive genes in ICB responders. These investigations are urgent now that ICB is a standard of care, and our findings provide a path toward identifying therapeutic targets and combinations to combat treatment resistance.
Methods
Identification of cancer cells（基因 + inferCNV）
Receptor-ligand interaction inference
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