文獻

2022

Developmental Cell?

Dynamic chromatin state profiling reveals regulatory roles of auxin and cytokinin in shoot regeneration

主要作者介紹

本文的通訊作者王佳偉老師，現在是中科院植物生理生態? 研究所的研究員，他的研究方向主要是利用基因編輯和組學技術研究植物時序性發育和生命周期。

研究背景

隨著基因編輯技術的快速發展，植物再生效率低 逐漸成為未來作物設計和改造 的瓶頸。植物的芽再生一般分為兩個步驟：首先，離體植物組織或者說外植體在 愈傷組織誘導培養基（CIM）上 誘導愈傷組織的形成，接下來在 芽誘導培養基（SIM）上誘導芽的發生。CIM富含生長素，生長素和細胞分裂素比例高；SIM富含細胞分裂素，細胞分裂素和生長素比例高。

過去十幾年的研究表明，芽的再生過程經歷了轉錄水平的大規模重塑，然而生長素和細胞分裂素? 如何在染色質水平? 依次調控 外植體細胞 的命運 轉變仍不清楚。

結論1?染色質狀態圖譜

Fig 1a

文章的第一部分，作者用兩種測序方式去構建? 芽再生過程中? 染色質狀態的圖譜。

如圖1a，作者選定了7個時期，按時間順序分別是處理0天，移到CIM培養基處理3天、5天、7天，然后移到SIM培養基上繼續處理3天、6天和8天。對這七個時期，作者都做了RNA-seq和ATAC-seq，然后對圖中標記橘黃色的三個時期做了這7種組蛋白的ChIP-seq。

簡單介紹下這7種組蛋白：

H3K9me2和H3K27me3在植物中往往定位于異染色質區域；

H3K9me3和H3K4me3在植物中分布在常染色質和轉錄基因區域；

H3K36me3修飾與愈傷組織形成和創傷誘導的根再生有關，通常與轉錄激活有關；

H3K4me1和H3K27ac在哺乳動物基因組往往分布在增強子區域。還利用兩種抗體做了RNA聚合酶Ⅱ的ChIP-seq，用來檢測RNA聚合酶Ⅱ的位置。

為了利用這些組學數據定義和區分染色質狀態，作者用到了ChromHMM軟件，ChromHMM可以根據ChIP-seq數據來定義和區分不同的染色質狀態，默認可以將染色質分為15種狀態。

Fig 1b

根據這個軟件的預測，可以分成15種染色質狀態。圖1b橫向看每一行就是對應了每一種染色質狀態。

縱向看第一個表明這批數據是哪個時期的，這個圖用的是在SIM處理3天的數據，第二個熱圖表示ATAC-seq信號強度以及7種組蛋白?? 和兩種抗體拉的RNA聚合酶Ⅱ的信號強度，第三個柱狀圖是coverage，由于ChromHMM軟件定義染色質狀態時按照一定大小的bin劃分然后統計的，所以這里的coverage就是這一類染色質狀態的bin占全基因組長度的比例。第四個熱圖是對這些bin對基因組不同特征進行了注釋，第五個boxplot代表這些bin的序列在所有十字花科物種中的保守性，一般而言那些更重要的bin更保守，第六個和第七個boxplot分別是RNA-seq和ATAC-seq的boxplot表示轉錄和可及性的FPKM

整體上看紅色框標記的是那些轉錄活躍，染色質開放的區域，黑色框標記的是轉錄被抑制，染色質致密的區域。沒有被標記的S10染色質高度開放，但是看到了較低的轉錄活性。

這15種染色質狀態又可以對應6大功能類。

1.S1-S4與轉錄區域高度共定位，可以認為是轉錄狀態，但是S1僅僅高度富集H3K4me1，生物學功能還不是很清楚，作者暫且稱它為H3K4me1 island 2.S5是下游調控區，因為它在3’ UTR和TES的側翼區域中過度表示，并且可及性較高 3.S6-S9可以認為是啟動子區域或者說TSS側翼區域，H3K9me3、H3K27ac、H3K4me3和H3K36me3這些激活型組蛋白標記均高度富集 4.S11-S14是異染色質狀態，更富集H3K9me2 和 H3K27me3 5.S15可以算是一個背景狀態

Fig 1c

S10被認為是增強子區域，因為它有較高的染色質可及性以及最豐富的轉錄因子結合位點。

總體而言，作者提供的數據集繪制了芽再生過程中表觀遺傳、染色質可及性以及轉錄活性的全局視圖。

Fig 2a-b

Fig 2c

然后作者選定了在CIM培養7天和在SIM培養3天兩個時間，用圈圖之間的連線表示不同染色質狀態的轉變，b圖表示從CIM上培養七天到SIM上培養三天的每個染色質狀態的過渡事件的百分比。例如，CIM7中20.8%的S1區域經歷染色質轉變。可以發現整體上有大量的染色質狀態在這兩個時期發生了轉變。并且在異染色質區域，發生了非常多的S13-S14的轉變。

因為S10標志著結合轉錄因子的染色質開放區域，所以作者仔細研究了S10狀態的轉換，在S10的轉變分為兩種，一種是從其他狀態轉入S10，一種是從S10轉到其他狀態。有65.7%的區域從S10轉入了S15，根據GO富集，這部分基因主要參與生長素反應，側根發育和根形態發生。

50.23%的區域從S15轉入了S10，根據GO富集，這部分基因與表皮細胞分化、細胞分裂素反應以及次生代謝相關。

結論2?CIM-SIM過程染色質可及性的改變

Fig 3a

為了更好的描述在這七個時期可及性的動態變化，作者把七個時期call到的peak merge起來，然后利用k-means聚類把可及性的動態變化分成了十個cluster，在Fig 3a上分別是C1-C10，右邊顯示了每一個cluster中具有代表性的基因，折線圖代表的每一個cluster可及性的變化趨勢。

Fig 3b

C1表示在CIM上逐漸失去可及性，轉到SIM后逐漸獲得可及性，這部分涉及的基因主要與細胞的伸長和分化相關，作者還發現了幾個與光合作用相關的基因。并且用轉錄組數據看了可及性的降低和升高對應了轉錄的降低和升高。

C4中的位點在CIM上顯示出可及性逐漸增加，一旦轉移到SIM上，這些地方就關閉了，GO富集分析顯示這些基因與全能性相關。

C5和C9在CIM上培養時也是可及性逐漸增加，當轉移到SIM時，沒有像C4那樣直接關閉，而是仍保留一定的可及性。這部分涉及的基因與芽發育相關。所以作者認為? 高濃度的? 生長素? 可以通過? 提高芽再生相關基因?? 的可及性來啟動芽再生。作者在這里還發現CUC2/REV和KAN1 ? 這幾個與芽再生密切相關的基因?? 直到在CIM培養第五天?? 才表現出開放并表達，這可以部分解釋? 為什么? 現在的芽再生方案?? 要求至少在CIM上培養五天。

C2在CIM中可及性較低，表達量較低，轉到到SIM后可及性逐漸上升? 并表達。這一類基因與響應細胞分裂素和芽發育相關。并且在這里還發現了ARR基因，這是一類響應細胞分裂素的反應調節因子。目前在擬南芥基因組中共發現了10個A型的ARR基因和11個B型ARR基因。B型ARRs基因可分為3個亞家族, 它們都具有一個保守的信號接收域和一個大的C端延伸結構域, 在C端延伸結構域中有保守的GARP結構域, B型ARR ?可以通過GARP結構域?? 直接和靶基因結合? 并激活其轉錄。

Fig S6b–S6d

Fig 4a

在SIM中細胞分裂素? 一般是通過誘導芽發育相關的基因促進芽再生。然而，目前尚不清楚細胞分裂素是否也在CIM中發揮重編程功能。為了研究這個問題，作者比較了野生型和B型ARR基因的突變體之間的染色質可及性差異。作者重點研究了ARR1-ARR10-ARR12三個基因，發現三者存在一定的冗余性，單突、雙突的表型沒有非常明顯，直到三突才有了非常明顯的變化 (Fig S6b–S6d)。并且利用它們的可及性數據做PCA，表現出了一致且明顯的趨勢（Fig 4a）。

Fig 4b-c

BP、PHV和REV等芽識別基因以及PLT3、PLT5和PLT7等多能基因在野生型和三突幼苗中的可及性相似，基本沒有變化，但是培養在CIM和SIM上培養會發現這些基因的可及性在三突中下調。剛剛提到了ARR是響應細胞分裂素的下游調節因子，在沒有外緣細胞分裂素的時候，這個調節因子無論在還是不在，基本沒什么影響，但是一旦有了外緣細胞分裂素的進入，缺乏ARR會導致許多基因可及性下調（Fig 4b-c）。

Fig 4f

作者由此構建了一個模型，如圖，粉紅線條代表前面的cluster1，可及性逐漸關閉，這部分涉及的基因主要與細胞的伸長和分化相關，紫色線條代表前面的cluster4，在CIM中培養過程中可及性增大，轉到SIM后可及性關閉，這部分基因與全能性相關，橘黃色線條代表前面的cluster2，當轉到SIM后，可及性逐漸升高，這部分基因與芽發育密切相關。在缺乏B型ARR的時候，通過細胞分裂素的作用，全能性基因以及芽發育相關基因的可及性無法建立，即推測細胞分裂素也可以在CIM中發揮重編程功能。

結論3?鑒定芽再生過程的轉錄因子

Fig 5a

Fig 5b

Fig 5d

作者根據TOBIAS軟件的計算找到了七個時期中發揮功能的轉錄因子，并計算了平均得分，得分越高說明這種轉錄因子在芽再生過程中出現的次數越多，可能就越重要。

圖a是按照得分從高到底排序，可以看到最重要的幾種轉錄因子是bHLH, bZIP, TCP, BES1, 說明這些轉錄因子主要參與各個時期的芽再生。有趣的是，bZIP和TCP都與植物三維染色質結構的形成有關。

B圖展示了在這七個時期，具體的轉錄因子的表達的活躍程度。可以發現ARF，bZIP, LBD, PLT幾個轉錄因子家族在CIM階段最活躍。B型的ARR、WUS、還有MYB、PIF以及IDD家族在SIM階段更活躍，表明這些轉錄因子對芽形成至關重要。

D圖又進一步結合熱圖展示了幾種轉錄因子的活躍階段。

Fig 5e-f

行文至此，作者要開始用? 實驗去驗證? 找到的這些轉錄因子? 是否真的對芽再生? 有影響。作者確定了四個標準去確定待驗證的轉錄因子。

第一個標準是在TOBIAS里得分最高的轉錄因子家族。

第二個標準是在芽再生的某些階段活躍的轉錄因子家族，這兩條標準都是基于ATAC-seq數據預測的轉錄因子足跡。

第三個標準是利用轉錄組數據檢測這些轉錄因子的表達情況，并且作者分成了兩類，一類是之前已經發現被研究過的，就是左邊這個熱圖，一類是在本文中剛發現的，就是右邊這個熱圖。

Fig 6

第四個標準是選擇那些在可及性上有明顯變化的轉錄因子。

符合上述條件三條或者四條的被優先選擇。這里需要注意下最后選出的轉錄因子可能對芽再生有正向作用，也可能有負向作用。

作者用到了兩個指標去衡量芽再生能力，一個是再生能力，它表示每個外植體再生芽的數量，另一個是再生率，它用能夠再生芽的外植體的百分率來表示。上面這個圖是再生能力，下面這個圖是再生率。

作者首先選擇了TCP家族去驗證，這個家族在芽再生過程中的功能在2020年的一篇文章中已經進行過研究。MIM319是TCP的過表達植株，JAW-D是下調TCP表達的植株，可以看到當過表TCP時，芽再生能力和芽再生率都極顯著降低，當TCP表達下調時，芽再生能力有所提高。這些結果表明，TCP限制了芽的再生。

然后作者驗證了BB家族，轉錄組測序表明，這些基因在CIM0中高表達，此后略有下降，一旦愈傷組織轉移到SIM中，這些基因的表達逐漸增加。作者對BB家族中的BES1做了RNAi，與野生型相比，BES1 RNAi植株的再生芽數量增加了近4倍。之前的研究發現，BES1與三個bHLH家族的轉錄因子bim1-bim2-bim3有明顯互作。當把bim1/2/3都突掉之后，可以看到與BES1 RNAi植株類似的表型。

轉錄組測序表明，BES1可能通過抑制這幾個? 芽識別基因? 和降低內源細胞分裂素水平來抑制芽再生。

擬南芥中IDD轉錄因子家族一共有16個成員，屬于植物特有的轉錄因子家族，這個家族含有ID結構域。當過表時再生的芽的? 數量明顯增加，idd3突變體和idd5突變體的再生率沒有受到影響，但是每個愈傷組織的芽數明顯低于野生型。

MYC和PIF都屬于bHLH家族，myc的三突和pif的四突都表現出再生能力的顯著下降。

最后，作者驗證了MYB家族的MYB93和B3家族的NGA這個基因，這兩個家族的啟動子中觀察到了SIM階段特異性的可及峰，它們的突變體均表現出再生能力的下降。

以上結果表明，轉錄因子足跡分析、染色質狀態、轉錄因子轉錄水平分析 以及發育遺傳學使我們能夠高精度地揭示與芽再生有關的轉錄因子。

總結

最后，總結一下這篇文章，首先亮點很明確，作者構建并描述了迄今為止在芽再生過程中最完整的組蛋白、可及性以及轉錄組圖譜，并把染色質可及性? 與芽再生關聯起來。利用這些數據作者?? 大范圍的鑒定了芽再生過程中涉及的轉錄因子，并進行了相應的實驗驗證以說明這種鑒定方法的準確性。

在最后的討論部分，作者對這篇文章的局限性也進行了說明，由于作者用的是bulk cell 測序，而非單細胞測序，這導致在這一堆細胞中 ??或者說在這個細胞群體中? 只有一部分? 是比較重要的多能細胞和?? 芽的前體細胞，有一些生物學現象可能因為?? 被稀釋而沒有發現，因此構建單細胞的相應圖譜?? 在未來是有必要的。

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