細(xì)胞重編程（將已分化的體細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（Induced pluripotent stem cell, iPSC））利用過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子或使用化學(xué)小分子組合等策略實(shí)現(xiàn)細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)換，在疾病模型、藥物篩選和再生醫(yī)學(xué)中具有廣泛應(yīng)用前景。2023年8月7日，浙江大學(xué)生命科學(xué)研究院祝賽勇教授團(tuán)隊(duì)在Nature Cell Biology發(fā)表題為A fast chemical reprogramming system promotes cell identity transition through a diapause-like state的文章，研究人員通過大規(guī)模的化學(xué)分子篩選，建立了快速化學(xué)重編程系統(tǒng)（FCR），其快速的動(dòng)力學(xué)和高效率大大加快了細(xì)胞重編程的過程，為細(xì)胞重編程全面特征和分子機(jī)制提供了獨(dú)特見解。
研究思路
主要結(jié)果
1.確定關(guān)鍵分子，構(gòu)建高效快速的FCR系統(tǒng)
研究人員利用大規(guī)模的化學(xué)篩選方法確定了一系列有效分子，通過調(diào)整有效小分子的濃度和處理時(shí)間，建立了快速化學(xué)重編程（FCR）系統(tǒng)。其中，關(guān)鍵多能性基因Oct4在重編程第7天就已經(jīng)被激活，進(jìn)一步說明了FCR的快速性。通過細(xì)胞、分子和功能實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)過12天FCR產(chǎn)生的iPSC細(xì)胞在形態(tài)、分子和功能上與小鼠胚胎干細(xì)胞相似，表明FCR平臺(tái)成功重編程。
2.多組學(xué)測序探究FCR過程中關(guān)鍵分子機(jī)制
2.1 ATAC-seq預(yù)測胚外內(nèi)胚層相關(guān)的TFs
間充質(zhì)向上皮轉(zhuǎn)化(MET)和胚外內(nèi)胚層(XEN)狀態(tài)已被證明是CR過程中的關(guān)鍵狀態(tài)。研究人員發(fā)現(xiàn)FCR與轉(zhuǎn)錄因子重編程（TFR）都會(huì)經(jīng)歷這兩種狀態(tài)，但在重編程路徑上有明顯差別，ATAC-seq組學(xué)預(yù)測胚外內(nèi)胚層相關(guān)的TFs(Sox17、Gata4、Gata6和Foxa2)導(dǎo)致了兩個(gè)重編程體系的路徑差異。
2.2 RNA-seq顯示FCR會(huì)經(jīng)歷一個(gè)獨(dú)特的滯育類狀態(tài)
選取了8個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)的樣本：0天、2天、4天、6天、8天、10天、12天、產(chǎn)生的iPSC cell。研究人員對(duì)比不同時(shí)間點(diǎn)不同重編程系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)：FCR后期顯著下調(diào)了核糖體、剪切體、DNA復(fù)制相關(guān)基因，但在TFR過程中并無此現(xiàn)象。這一結(jié)果揭示了FCR重編程后期會(huì)經(jīng)歷一個(gè)獨(dú)特的滯育類狀態(tài)。
2.3滯育類狀態(tài)是FCR過程中一個(gè)重要的中間態(tài)
考慮到細(xì)胞異質(zhì)性，研究人員選取5個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣本：0天、4天、8天、12天、iPSC cell進(jìn)行scRNA-seq分析，F(xiàn)CR依次會(huì)經(jīng)歷成纖維細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞、中間態(tài)細(xì)胞、新生iPSC和iPSC階段，且scRNA-seq功能通路數(shù)據(jù)與RNA-seq結(jié)果一致，滯育相關(guān)基因在FCR后期細(xì)胞呈現(xiàn)明顯下調(diào)。敲低促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入滯育狀態(tài)的關(guān)鍵基因Larp1、Slc17a5、Prkaa1發(fā)現(xiàn)抑制滯育類狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致FCR效率降低，說明滯育類狀態(tài)是FCR過程中一個(gè)重要的中間態(tài)。
2.4 ATAC+CUT&Tag證明H3K9me3通過抑制iPSC相關(guān)的ERVs影響FCR進(jìn)程
選取了8個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)的樣本：0天、2天、4天、6天、8天、10天、12天、產(chǎn)生的iPSC cell，通過ATAC-seq&CUT&Tag多組學(xué)分析顯示：染色質(zhì)可及性區(qū)域大部分在FCR過程中呈現(xiàn)高度動(dòng)態(tài)，即使在FCR后期的滯育類狀態(tài)，且伴隨著不同組蛋白修飾的動(dòng)態(tài)變化。
H3K9me3作為異染色質(zhì)區(qū)域的標(biāo)志性沉默修飾，此前多次被證實(shí)在干細(xì)胞中可以調(diào)控ERVs。而在FCR過程中，ERVs的表達(dá)模式也呈現(xiàn)從MEF向iPSC的動(dòng)態(tài)變化，說明了ERVs可能也會(huì)參與并影響重編程過程。該研究篩選了24個(gè)受H3K9me3調(diào)控的iPSC相關(guān)的ERVs（經(jīng)典Oct4-Sox2-Tcf-Nanog?TF基序）。敲低和小分子抑制實(shí)驗(yàn)證明H3K9me3甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制可以促進(jìn)FCR進(jìn)程；而敲低iPSC相關(guān)ERVs相關(guān)靶蛋白會(huì)導(dǎo)致FCR效率降低。這些結(jié)果說明H3K9me3通過抑制iPSC相關(guān)的ERVs從而作為FCR的障礙。
結(jié)論
本篇研究發(fā)明的FCR化學(xué)重編程系統(tǒng)獨(dú)特地過渡到滯育類狀態(tài)，快速完成細(xì)胞的“返老還童”。更有趣的是，異染色質(zhì)修飾蛋白H3K9me3在FCR過程中通過調(diào)控iPSC相關(guān)的ERVs的表達(dá)，參與了細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳組的重塑，從而推動(dòng)了細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)換。這一研究結(jié)果完善了細(xì)胞重編程機(jī)制以及在干細(xì)胞研究和再生醫(yī)學(xué)方面具有廣泛的應(yīng)用前景。
